Developing a microbial screening assay for plant extracts, fractions and purified compounds

Abstract

According to the World Health Organization, antimicrobial resistance is one of the most prevalent threats the modern world currently faces. Scientists are faced with finding and procuring new alternatives to older inefficient antibiotics. Specialized plant metabolites have shown great promise in this area of research. Due to the active crisis, new faster and more sensitive screening methods for detecting and identifying inhibitory potential against pathogenic micro-organisms within different plants and plant compounds, specifically polyphenols. The aim of this research was to create an optimized, fast and sensitive screening platform for different types of plant extracts. In this research the assay was optimized for plant extracts, fractionated extracts and includes various strains of pathogenic microbes as well as a probiotic bacterium and a strain of fungus. When created and optimized, the aim was to understand the activity correlations between different type of plant samples. Specific interest was applied to whether the activity of a plant extract could be explained though the activities of pure plant compounds. Method deployed in this research was broth microdilution assays where the inhibitory action was measured by absorbance at 600 nm. Other analysis methods included compound purification and analysis using various liquid chromatography and mass spectrometry applications. During the research a functional assay was created and used in screening hundreds of different sample types. The main result was that activities were detected across all sample types against all the microbes. In addition to this some of the plant samples seemed to promote microbial growth instead of inhibiting it. Based on the research, the initial conclusion was that the activity of the extract cannot only be attributed to its purified constituents, but in order to confirm this, more analysis is needed. Moreover, since some of the samples promoted microbial growth, the proposed effect of antagonies in the analysis matrix was discovered. With the screening assay, a conclusive microbial activity – structure library can be created in the future and with the use of mathematical tools, correlation between polyphenols and their effect on each microbe can be deduced.

Antibioottien heikkenevä inhibitiokyky on ollut ja tulee olemaan vaikuttava tekijä nykyhetken ja tulevaisuuden tutkimuksessa. Maailman terveysjärjestö WHO:n mukaan antibiooteille resistentit bakteerit ovat jo aiheuttaneet aktiivisen kriisitilan. Uusia antibioottikandidaatteja tarvitaan ja vastaus tähän ongelmaan voi löytyä kasvikunnasta ja sen tuottamista erikoistuneista metaboliiteista. Kasviyhdisteiden antibioottipotentiaalia on jo tutkittu laajasti, mutta kaiken kattavaa ja herkkää seulontamenetelmää tullaan tarvitsemaan ohjaamaan tutkimusta oikein kasvilajien ja niiden yhdisteiden suuntaan. Tutkimuksen tarkoituksena oli luoda funktionalisoitu seulontamenetelmä erityyppisille kasvinäytteille, jotka olivat tässä tutkimuksessa kasviuutteet, uutteista valmistetut fraktiot sekä puhdasaineet. Tämän lisäksi menetelmän avulla näytteet testattiin niiden inhibitiopotentiaalia varten montaa erilaista mikrobityyppiä vastaan. Käytetyistä mikrobeista suurin osa oli tunnettuja patogeeneja eli taudinaiheuttajia ja näiden lisäksi analyysimenetelmä oli suunniteltu sisältämään myös tunnetun hyödyllisen bakteerin eli probiootin sekä hiivakannan. Näiden mikrobien yhdistelmällä varmistettiin laaja aktiivisuuskirjo näytettä kohden ja pystyttiin analysoimaan tarkemmin tiettyjä mikrobi-näyte-vuorovaikutuksia. Tutkimuksen tavoitteena oli myös arvioida sitä, pystytäänkö kasviuutteen aktiivisuutta selittämään sen sisältämien puhdasaineiden aktiivisuuksien kautta. Menetelmän pääanalyysitapa oli mikrobin elinkelpoisuusmääritys absorbanssin kautta. Tämän lisäksi keskeisiä analyysimenetelmiä olivat nestekromatografia ja massaspektrometria, jota hyödynnettiin yhdisteiden puhdistukseen, karakterisointiin sekä polyfenolisormenjäljen määrittämiseen. Tutkimuksen tuloksena syntyi optimoitu analyysi- ja seulontamenetelmä, joka oli optimoitu erikseen kaikkia eri kasvinäytetyyppejä sekä eri mikrobeja varten. Tämän avulla pystyttiin todistamaan inhibitiopotentiaalia eri kasvinäytteissä kaikkia mikrobeja vastaan. Toinen tärkeä tulos oli se, että osa kasviyhdisteistä lisäsi mikrobien kasvua inhibition sijaan. Tutkimuksen tuloksena voitiin päätellä, ettei kasviuutteen aktiivisuutta voinut yhdistää suoraan sen puhdasaineiden aktiivisuuteen, mutta lisää tutkimusta vaaditaan tämän päätelmän tukemiseksi ja todistamiseksi. Muiden havaintojen perusteella tehtiin myös johtopäätelmä, että uutteen aktiivisuus ei ole vain sen yksilötekijöiden aktiivisuuksien summa, vaan näytematriisissa näytteet vuorovaikuttavat myös keskenään synergisesti tai antagonisesti, mikä vaikutti vahvasti näytteen inhibitiopotentiaaliin.