Separation, purification and HR-MS detection of polymeric ellagitannins

Abstract

Ellagitannins, a class of hydrolysable tannins, are specialized metabolites that plants produce to protect themselves against pathogens and herbivores. Species within the Onagraceae family, such as fireweed (Chamaenerion angustifolium) and evening primrose (Oenothera biennis), are known to produce oligomeric and polymeric ellagitannins composed of tellimagrandin I monomers. These plants have been used in traditional medicine for treating e.g. wounds, burns, obesity, aches, pain and cough. Extracts made of these plants have been shown to have properties that support their traditional medicinal uses. Tellimagrandin I-based oligomers have been found to have various bioactivities such as protein precipitation activity, oxidative activity, anti-herbivore activity, anthelmintic activity and antimicrobial activity. While reversed-phase chromatography has enabled the separation and purification of tellimagrandin I-based oligomers up to heptamers, and detection and characterization of polymers up to undecamers, the analysis of polymeric ellagitannins have remained analytically challenging due to limitations of separation methods. To fill this gap in the field of ellagitannin research, a size-exclusion chromatographic (SEC) method for polymeric ellagitannins was developed and optimized. This new SEC method coupled with high-resolution mass spectrometry enabled the separation, detection and characterization of completely novel, previously unobserved, tellimagrandin I-based polymeric ellagitannins from dodecamer to pentadecamer from C. angustifolium and O. biennis. These polymeric ellagitannins have not been previously reported to be found in any plant species. The molecular mass calibration curve for this method was linear (R² = 0.9986) in the molecular range of 4,700−11,800 Da. By utilizing this calibration curve, this new method enables the discovery of the world’s largest ellagitannin polymers by the UV detection alone. This method provided evidence suggesting the existence of even larger ellagitannins beyond the characterized polymers, but their structures remained unresolved. This method was also used to purify oligomers larger than heptamer, up to nonamer. This new SEC method represents a significant breakthrough in ellagitannin research, overcoming prior limitations in the separation, purification and detection of oligomeric and polymeric ellagitannins. This method will allow other researchers to isolate and identify the largest ellagitannins found in the plant kingdom. This is a significant advancement for the field of ellagitannin chemistry, as many researchers are currently limited to working with oligomers up to pentamers.

Ellagitanniinit kuuluvat hydrolysoituviin tanniineihin ja ovat kasvien tuottamia erikoistuneita metaboliitteja, joita kasvit tuottavat suojautuakseen patogeeneiltä ja kasvinsyöjiltä. Horsmakasveihin kuuluvat kasvit, kuten maitohorsma (Chamaenerion angustifolium) ja iltahelokki (Oenothera biennis), tuottavat oligomeerisiä ja polymeerisiä ellagitanniineja, jotka koostuvat tellimagrandiini I -nimisistä monomeereistä. Näitä kasveja on käytetty perinteisessä lääketieteessä muun muassa haavojen, palovammojen, liikalihavuuden, särkyjen, kivun ja yskän hoitoon. Kasviuutteilla on osoitettu olevan ominaisuuksia, jotka tukevat niiden perinteistä lääkinnällistä käyttöä. Oligomeereillä ja polymeereillä, jotka koostuvat tellimagrandiini I -monomeereistä, on havaittu olevan erilaisia bioaktiivisuuksia, kuten proteiinien saostuskyky, oksidatiivinen aktiivisuus, antiherbivoriaktiivisuus, loisten vastainen aktiivisuus ja antimikrobinen aktiivisuus. Vaikka käänteisfaasikromatografia on mahdollistanut tellimagrandiini I -monomeereistä koostuvien oligomeerien erottamisen ja puhdistamisen heptameeriin asti sekä polymeerien detektoinnin ja karakterisoinnin undekameeriin asti, polymeeristen ellagitanniinien analysointi on pysynyt analyyttisesti haastavana erotusmenetelmien rajoitusten vuoksi. Tässä tutkimuksessa kehitettiin ja optimoitiin kokoekskluusiokromatografinen (engl. size-exclusion chromatography, SEC) menetelmä polymeerisille ellagitanniineille. Tämä uusi SEC-menetelmä yhdistettynä korkean resoluution massaspektrometriaan mahdollisti täysin uusien, aiemmin havaitsemattomien, tellimagrandiini I -monomeereistä koostuvien polymeeristen ellagitanniinien erottamisen, detektoinnin ja karakterisoinnin dodekameeristä pentadekameeriin asti maitohorsma- ja iltahelokkinäytteistä. Näitä polymeerisiä ellagitanniineja ei ole aiemmin raportoitu löytyvän mistään kasvilajista. Menetelmän kalibraatiosuora oli lineaarinen (R² = 0,9986) molekyylipainoalueella 4 700–11 800 Da. Käyttämällä tätä kalibraatiosuoraa tämä uusi menetelmä mahdollistaa maailman suurimpien ellagitanniinipolymeerien löytämisen pelkästään UV-detektoinnilla. Karakterisoitujen polymeerien lisäksi tällä menetelmällä saatiin myös todisteita, jotka viittaavat vielä suurempien polymeeristen ellagitanniinien olemassaoloon. Menetelmää käytettiin myös heptameeriä suurempien oligomeerien puhdistamiseen, ja sillä saatiin puhdistettua oligomeerejä aina nonameeriin asti. Tämä uusi SEC-menetelmä on merkittävä läpimurto ellagitanniinitutkimuksessa, sillä se ylittää aiemmat rajoitukset oligomeeristen ja polymeeristen ellagitanniinien erottamisessa, puhdistamisessa ja detektoinnissa. Tämä menetelmä antaa muille tutkijoille mahdollisuuden erottaa ja karakterisoida kasvikunnassa esiintyvät suurimmat ellagitanniinit. Tämä on merkittävä edistysaskel ellagitanniinikemian alalla, sillä monet tutkijat työskentelevät tällä hetkellä vain enintään pentameeristen oligomeerien kanssa.