Homogeeninen ei-kilpaileva anti-immunokompleksi TR-FRET määritys testosteronin havaitsemiseen

Abstract

Testosteronitasojen tarkka ja nopea mittaaminen on välttämätöntä androgeenisten häiriöiden, mukaan lukien androgeeneja tuottavien kasvainten diagnosoinnissa. Nykyiset testosteronin mittaukseen käytettävät menetelmät, kuten kilpailevat immunomääritykset tai kromatografisten menetelmien ja massaspektrometrian yhdistelmät, ovat joko epäluotettavia, tai eivät sovellu suurien näytemäärien analysointiin. Terveydenhuollossa on tarve nopealle ja luotettavalle testosteronimääritykselle.

Testosteronia mittaavien immunomääritysten rajoitteena on testosteronin pieni molekyylikoko ja vähäinen sitoutumiskohtien määrä. Immunokomplekseihin sitoutuvat vasta-aineet mahdollistavat ei-kilpailevien sandwich-immunomääritysten kehittämisen pienen molekyylikoon analyyteille ja kehittyneiden leimateknologioiden, kuten aikaerotteisen fluoresenssiresonanssienergian siirron (TR-FRET) käytön signaalin tuottamiseksi. Tässä tutkimuksessa hyödynnettiin aiemmin kehitettyä testosteroni-immunokompleksiin sitoutuvaa anti-immunokompleksi vasta-ainetta uuden, ei-kilpailevan TR-FRET-immunomäärityksen kehittämiseen vapaan testosteronin kvantitatiiviseen määrittämiseen.

Kehitetty homogeeninen, ei-kilpaileva TR-FRET-immunokompleksimääritys aikaansai onnistuneen FRET energiansiirron ja signaalin testosteronin havaitsemiseksi. Määritys osoitti lupaavaa analyyttistä suorituskykyä saavuttaen 0,068 nM havaitsemisrajan ja 0,224 nM määritysrajan minimaalisella (CV% < 7,2) määritysten välisellä vaihtelulla. Määritys osoitti potentiaalia kliiniseen käyttöön erityisesti miespotilaiden vapaan testosteronin seulonnassa. Määrityksellä on runsaasti sovelluspotentiaalia vapaan testosteronin testauksessa kliinisessä käytössä ja erilaisissa vieritestausratkaisuissa.

Jatkokehityksen kannalta avainasemassa on korkeamman affiniteetin vasta-aineiden kehitys ja määrityksen laaja validointi. Määrityksen suorituskykyä voidaan edelleen kehittää paremman signaali-tausta-suhteen sekä kliinisen herkkyyden saavuttamiseksi korkeamman affiniteetin vasta-aineilla sekä hyödyntämällä tehokkaampia leimateknologioita, kuten nanopartikkeleita. Tutkimus tarjoaa perustan sekä testosteronin kliiniseen määritykseen soveltuvan menetelmän jatkokehittämiselle, että anti-immunokompleksi vasta-aineiden ja TR-FRET teknologian laajemmalle hyödyntämiselle pienimolekyylisten yhdisteiden analytiikassa.

Accurate and rapid measurement of testosterone levels is essential for the diagnosis of androgenic disorders, including androgen producing tumors. Current methods for testosterone measurement, such as competitive immunoassays or combinations of chromatographic techniques with mass spectrometry, are either unreliable or unsuitable for the analysis of large sample volumes. There is a clear need in healthcare for a rapid and reliable testosterone immunoassay.

A major limitation of testosterone immunoassays is the small molecular size of testosterone and the limited number of available binding sites. Antibodies that recognize immune complexes enable the development of non-competitive sandwich immunoassays for small-molecule analytes and allow the use of advanced labeling technologies, such as time resolved fluorescence resonance energy transfer (TR-FRET), for signal generation. In this study, a previously developed anti-immunocomplex antibody specific for a testosterone-antibody complex was utilized to establish a novel, non-competitive TR-FRET immunoassay for the quantitative determination of free testosterone.

The developed homogeneous, non-competitive TR-FRET immunocomplex assay successfully achieved FRET and signal generation for testosterone detection. The assay demonstrated promising analytical performance, reaching a detection limit of 0.068 nM and a quantification limit of 0.224 nM, with minimal inter-assay variation (CV% < 7,2). The method showed potential for clinical use, particularly for the screening of free testosterone in male samples. Moreover, the assay has considerable application potential for free testosterone testing in clinical diagnostics and in various point-of-care solutions.

For further development, the generation of higher-affinity antibodies and extensive assay validation are crucial. The performance of the assay can be further enhanced to achieve a better signal-to-background ratio and improved clinical sensitivity by employing higher-affinity antibodies and more advanced labeling technologies, such as nanoparticles. This study provides a foundation both for the development of a clinically applicable method for testosterone quantification and for the broader application of anti-immunocomplex antibodies and TR-FRET technology in small-molecule analytics.