Käänteisviritteisiä nanopartikkeleita hyödyntävän immunomäärityksen kehitys neurofilamentin kevytketjun havaitsemiseen
Lehmusmäki, Raakel (2025-10-14)
Käänteisviritteisiä nanopartikkeleita hyödyntävän immunomäärityksen kehitys neurofilamentin kevytketjun havaitsemiseen
(14.10.2025)
Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.
suljettu
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe20251112107291
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe20251112107291
Tiivistelmä
Neurofilamentin kevytketju-proteiini (NfL) on noussut lupaavaksi biomarkkeriksi neurologisten sairauksien, kuten Alzheimerin taudin, muiden dementioiden, multippeliskleroosin (MS-tauti) ja amyotrofisen lateraaliskleroosin (ALS), diagnostiikassa ja seurannassa. NfL-pitoisuuden muutokset heijastavat aksonivaurion astetta ja voivat toimia ennusteellisena indikaattorina useissa neurologisissa sairauksissa. NfL:n kliinistä käyttöä rajoittaa kuitenkin tarve herkille ja kustannustehokkaille analyysimenetelmille.
Käänteisviritteiset nanopartikkelit (UCNP) tarjoavat lupaavan ratkaisun, sillä ne muuttavat infrapunavalon näkyväksi fluoresenssiksi ilman taustan autofluoresenssia, mikä parantaa signaalin havaitsemista ja määrityksen herkkyyttä. Nämä ominaisuudet tekevät UCNP:stä erityisen sopivia biomarkkereiden havaitsemiseen monimutkaisista biologisista näytteistä. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kehittää erittäin herkkä immunomääritys NfL:n havaitsemiseksi hyödyntäen UCNP:tä leimateknologiana. Tavoitteena oli tutkia määritysolosuhteita diagnostiikan parantamiseksi ja mahdollistaa menetelmän käyttö verinäytteillä.
Kaksivaiheista immunomääritystä vertailtiin käyttämällä anti-h-NfL-12601-vasta-ainetta sitojavasta-aineena ja anti-h-12604-vasta-ainetta leimavasta-aineena sekä toisinpäin. Leimavasta-aineita testattiin kahdessa muodossa: joko suoraan polyakryylihapolla (PAA) pinnoitettuihin UCNP-partikkeleihin konjugoituna tai biotinyloituna ja streptavidiini-konjugoidun PAA-UCNP:n kanssa. Määritysolosuhteita tutkittiin arvioimalla seerumialbumiinin vaikutusta, UCNP:den reaktiokinetiikkaa sekä analyytti- ja detektiopuskurin koostumusta.
Parhaat määritysparametrit saavutettiin käyttämällä streptavidiinilla pinnoitettua 96-kuoppalevyä, biotinyloitua anti-h-NfL-12604-sitojavasta-ainetta ja PAA-UCNP-konjugoitua 12601-leimavasta-ainetta. Määrityspuskureita onnistuttiin kehittämään niin, että 5 ng/L analyyttipitoisuus pystyttiin havaitsemaan albumiini-vapaassa määrityksessä. Määrityksen havaitsemisraja oli kuitenkin vain 29,3 ng/L. Määritys ei ollut yhteensopiva albumiinin kanssa, mikä rajoittaa sen käyttöä verinäytteillä. Lisätutkimusta tarvitaan, jotta määritys on yhteensopiva verinäytteiden kanssa. Neurofilament light chain protein (NfL) is a promising biomarker for neurological diseases, reflecting axonal damage and serving as a prognostic indicator in conditions such as Alzheimer’s disease (AD), multiple sclerosis (MS) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). However, the clinical application of NfL detection is currently limited by the need for more sensitive and cost-effective analytical methods. Upconverting nanoparticles (UCNP) have emerged as powerful tools for ultrasensitive immunoassays due to their unique ability to convert infrared light into visible fluorescence without autofluorescence, enhancing signal detection and sensitivity. These properties make UCNPs particularly suitable for biomarker detection in complex biological samples. This study aimed to develop a sensitive and scalable UCNP-based immunoassay for NfL detection, evaluating different assay conditions to enhance diagnostic performance and support potential use in blood samples.
A two-step sandwich immunoassay format was tested using anti-h-NfL-12601-Mab as the capture antibody and anti-h-12604-Mab as the tracer, as well as in reverse orientation. Both antibodies were evaluated on a 96-well plate, either directly coated onto the plate or biotinylated and used with a streptavidin-coated plate. Tracer antibodies were tested in two formats: conjugated directly to polyacrylic acid coated (PAA) UCNP particles or biotinylated with streptavidin-conjugated PAA-UCNP. Assay conditions were optimized by evaluating the presence or absence of serum albumin, UCNP-conjugate amount and incubation time, and analyte and detection buffer compositions. Assay performance was also evaluated using blood-based matrixes.
The optimal assay configuration was achieved using a streptavidin-coated 96-well plate, with a biotinylated anti-h-NfL-12604-Mab as the capture antibody and a 12601-Mab conjugated to PAA-UCNPs as the tracer antibody. The assay buffers were adjusted to enable detection of 5 ng/L analyte concentrations in an albumin-free format. However, the signal-to-background ratio remained relatively low, resulting in a limit of detection (LoD) of only 29,3 ng/L. The assay was not compatible with serum albumin, which limits its applicability to blood-based samples. Additionally, the assay performance was suboptimal when tested with spiked blood samples. While detection of 5 ng/L analyte was technically possible under optimized conditions, the specific signal increase was weak. Further research is needed to enhance the signal-to-background ratio and achieve reliable detection of low analyte concentrations in the presence of albumin, enabling adaptation of the assay for blood sample analysis.
Käänteisviritteiset nanopartikkelit (UCNP) tarjoavat lupaavan ratkaisun, sillä ne muuttavat infrapunavalon näkyväksi fluoresenssiksi ilman taustan autofluoresenssia, mikä parantaa signaalin havaitsemista ja määrityksen herkkyyttä. Nämä ominaisuudet tekevät UCNP:stä erityisen sopivia biomarkkereiden havaitsemiseen monimutkaisista biologisista näytteistä. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kehittää erittäin herkkä immunomääritys NfL:n havaitsemiseksi hyödyntäen UCNP:tä leimateknologiana. Tavoitteena oli tutkia määritysolosuhteita diagnostiikan parantamiseksi ja mahdollistaa menetelmän käyttö verinäytteillä.
Kaksivaiheista immunomääritystä vertailtiin käyttämällä anti-h-NfL-12601-vasta-ainetta sitojavasta-aineena ja anti-h-12604-vasta-ainetta leimavasta-aineena sekä toisinpäin. Leimavasta-aineita testattiin kahdessa muodossa: joko suoraan polyakryylihapolla (PAA) pinnoitettuihin UCNP-partikkeleihin konjugoituna tai biotinyloituna ja streptavidiini-konjugoidun PAA-UCNP:n kanssa. Määritysolosuhteita tutkittiin arvioimalla seerumialbumiinin vaikutusta, UCNP:den reaktiokinetiikkaa sekä analyytti- ja detektiopuskurin koostumusta.
Parhaat määritysparametrit saavutettiin käyttämällä streptavidiinilla pinnoitettua 96-kuoppalevyä, biotinyloitua anti-h-NfL-12604-sitojavasta-ainetta ja PAA-UCNP-konjugoitua 12601-leimavasta-ainetta. Määrityspuskureita onnistuttiin kehittämään niin, että 5 ng/L analyyttipitoisuus pystyttiin havaitsemaan albumiini-vapaassa määrityksessä. Määrityksen havaitsemisraja oli kuitenkin vain 29,3 ng/L. Määritys ei ollut yhteensopiva albumiinin kanssa, mikä rajoittaa sen käyttöä verinäytteillä. Lisätutkimusta tarvitaan, jotta määritys on yhteensopiva verinäytteiden kanssa.
A two-step sandwich immunoassay format was tested using anti-h-NfL-12601-Mab as the capture antibody and anti-h-12604-Mab as the tracer, as well as in reverse orientation. Both antibodies were evaluated on a 96-well plate, either directly coated onto the plate or biotinylated and used with a streptavidin-coated plate. Tracer antibodies were tested in two formats: conjugated directly to polyacrylic acid coated (PAA) UCNP particles or biotinylated with streptavidin-conjugated PAA-UCNP. Assay conditions were optimized by evaluating the presence or absence of serum albumin, UCNP-conjugate amount and incubation time, and analyte and detection buffer compositions. Assay performance was also evaluated using blood-based matrixes.
The optimal assay configuration was achieved using a streptavidin-coated 96-well plate, with a biotinylated anti-h-NfL-12604-Mab as the capture antibody and a 12601-Mab conjugated to PAA-UCNPs as the tracer antibody. The assay buffers were adjusted to enable detection of 5 ng/L analyte concentrations in an albumin-free format. However, the signal-to-background ratio remained relatively low, resulting in a limit of detection (LoD) of only 29,3 ng/L. The assay was not compatible with serum albumin, which limits its applicability to blood-based samples. Additionally, the assay performance was suboptimal when tested with spiked blood samples. While detection of 5 ng/L analyte was technically possible under optimized conditions, the specific signal increase was weak. Further research is needed to enhance the signal-to-background ratio and achieve reliable detection of low analyte concentrations in the presence of albumin, enabling adaptation of the assay for blood sample analysis.