Escherichia colin DnaA-proteiini ja epäorgaanisen pyrofosfataasin aktiivisuus lämpötilaherkässä dnaAts-mutanttikannassa
Ahvenniemi, Arna (2025-11-17)
Escherichia colin DnaA-proteiini ja epäorgaanisen pyrofosfataasin aktiivisuus lämpötilaherkässä dnaAts-mutanttikannassa
(17.11.2025)
Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.
suljettu
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe20251124110835
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe20251124110835
Tiivistelmä
DNA-replikaatio on bakteerisoluille elintärkeä tapahtuma, jonka tarkka ajoitus ja säätely takaavat geneettisen informaation virheettömän siirtymisen sukupolvelta toiselle. Escherichia coli -bakteerissa tämän prosessin käynnistää DnaA-proteiini, ATP- ja ADP-molekyyleihin sitoutuva säätelijä, joka määrittää milloin replikaation aloituskohta (oriC) aktivoituu.
DnaA:n toiminta perustuu spesifisten DNA-sekvenssien tunnistamiseen, proteiinien välisiin vuorovaikutuksiin, DNA:n topologisiin muutoksiin sekä ATP:n ja ADP:n sitoutumisen säätelyyn. Proteiinin toiminta ei rajoitu pelkästään DNA-replikaation aloitukseen, vaan ulottuu myös solusyklin etenemisen ja geenien ilmentymisen säätelyyn. DnaA yhdistää replikaation aloitukseen tarvittavan geneettisen, metabolisen ja topologisen informaation ja mukauttaa toimintansa nopeasti solunsisäisiin ja ulkoisiin muutoksiin geneettisen, rakenteellisen ja biokemiallisen säätelyn välityksellä.
DnaA ei ole ainoastaan DNA-replikaation käynnistäjä, vaan myös koko solusyklin keskeinen rytmittäjä. Sen monitasoinen säätely ja keskeinen rooli solun kasvussa tekevät DnaA:sta ajankohtaisen ja merkittävän tutkimuskohteen erityisesti potentiaalisten antibakteeristen lääkeaineiden kehittämisessä. Näiden tutkimusten tavoitteena on tunnistaa yhdisteitä, jotka vaikuttavat E. colin DnaA:n rakenteisiin ja säätelyreitteihin estämällä DNA:n kahdentumisen ja bakteerin jakautumisen.
E. colin epäorgaaninen pyrofosfataasi (PPaasi) on solunsisäinen entsyymi, jota on perinteisesti pidetty konstitutiivisesti eli jatkuvasti tuotettuna. Tutkimusryhmän aiemmassa, lämpötilaherkällä dnaAts -mutanttikannalla tehdyssä tutkimuksessa oli havaittu PPaasin spesifisen aktiivisuuden vähenevän entsyymin suhteellisen synteesinopeuden laskiessa. Havainnon perusteella esitettiin hypoteesi, että PPaasin tuotanto ei ole konstitutiivista, vaan säädeltyä. Tämän hypoteesin jatkotutkimiseksi laadittiin kolme erillistä hypoteesia, joiden avulla tarkasteltiin aiemman havainnon toistettavuutta, yleistettävyyttä sekä DNA-synteesin ajoituksen vaikutusta PPaasin spesifiseen aktiivisuuteen. Tutkimus toteutettiin käyttäen E. coli -mutanttikantoja, joissa DNA-synteesi voitiin hallitusti joko käynnistää tai estää.
Tulokset osoittivat, ettei PPaasin spesifisessä aktiivisuudessa tapahtunut merkittäviä muutoksia DNA-synteesin eston tai käynnistyksen yhteydessä. Hypoteesit hylättiin, sillä tulokset eivät tukeneet oletusta DNA-synteesin säätelyn vaikutuksesta PPaasin spesifiseen aktiivisuuteen. Tutkimus vahvistaa käsityksen, että PPaasi on konstitutiivisesti tuotettu entsyymi, jonka ilmentyminen on jatkuvaa ja osa solun perustason aineenvaihduntaa.
DnaA:n toiminta perustuu spesifisten DNA-sekvenssien tunnistamiseen, proteiinien välisiin vuorovaikutuksiin, DNA:n topologisiin muutoksiin sekä ATP:n ja ADP:n sitoutumisen säätelyyn. Proteiinin toiminta ei rajoitu pelkästään DNA-replikaation aloitukseen, vaan ulottuu myös solusyklin etenemisen ja geenien ilmentymisen säätelyyn. DnaA yhdistää replikaation aloitukseen tarvittavan geneettisen, metabolisen ja topologisen informaation ja mukauttaa toimintansa nopeasti solunsisäisiin ja ulkoisiin muutoksiin geneettisen, rakenteellisen ja biokemiallisen säätelyn välityksellä.
DnaA ei ole ainoastaan DNA-replikaation käynnistäjä, vaan myös koko solusyklin keskeinen rytmittäjä. Sen monitasoinen säätely ja keskeinen rooli solun kasvussa tekevät DnaA:sta ajankohtaisen ja merkittävän tutkimuskohteen erityisesti potentiaalisten antibakteeristen lääkeaineiden kehittämisessä. Näiden tutkimusten tavoitteena on tunnistaa yhdisteitä, jotka vaikuttavat E. colin DnaA:n rakenteisiin ja säätelyreitteihin estämällä DNA:n kahdentumisen ja bakteerin jakautumisen.
E. colin epäorgaaninen pyrofosfataasi (PPaasi) on solunsisäinen entsyymi, jota on perinteisesti pidetty konstitutiivisesti eli jatkuvasti tuotettuna. Tutkimusryhmän aiemmassa, lämpötilaherkällä dnaAts -mutanttikannalla tehdyssä tutkimuksessa oli havaittu PPaasin spesifisen aktiivisuuden vähenevän entsyymin suhteellisen synteesinopeuden laskiessa. Havainnon perusteella esitettiin hypoteesi, että PPaasin tuotanto ei ole konstitutiivista, vaan säädeltyä. Tämän hypoteesin jatkotutkimiseksi laadittiin kolme erillistä hypoteesia, joiden avulla tarkasteltiin aiemman havainnon toistettavuutta, yleistettävyyttä sekä DNA-synteesin ajoituksen vaikutusta PPaasin spesifiseen aktiivisuuteen. Tutkimus toteutettiin käyttäen E. coli -mutanttikantoja, joissa DNA-synteesi voitiin hallitusti joko käynnistää tai estää.
Tulokset osoittivat, ettei PPaasin spesifisessä aktiivisuudessa tapahtunut merkittäviä muutoksia DNA-synteesin eston tai käynnistyksen yhteydessä. Hypoteesit hylättiin, sillä tulokset eivät tukeneet oletusta DNA-synteesin säätelyn vaikutuksesta PPaasin spesifiseen aktiivisuuteen. Tutkimus vahvistaa käsityksen, että PPaasi on konstitutiivisesti tuotettu entsyymi, jonka ilmentyminen on jatkuvaa ja osa solun perustason aineenvaihduntaa.