ANO7:n rs77559646-variantin aiheuttaman silmukointivirheen korjaaminen muokatuilla spliseosomaalisilla U1- ja U6-snRNA:illa
Pellikka, Hilla (2026-01-15)
ANO7:n rs77559646-variantin aiheuttaman silmukointivirheen korjaaminen muokatuilla spliseosomaalisilla U1- ja U6-snRNA:illa
(15.01.2026)
Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.
avoin
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2026031820914
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2026031820914
Tiivistelmä
Eturauhassyöpä on miesten toiseksi yleisin syöpä maailmalla ja yksi periytyvimmistä ihmisen syövistä, koska noin 57 % riskistä selittyy geneettisillä tekijöillä. ANO7-geenin kromosomaalinen sijainti 2q37.3 on tunnistettu vahvaksi eturauhassyövän riskilokukseksi suomalaisilla. ANO7:n rs77559646-variantti on yhteydessä aggressiiviseen eturauhassyöpään. Variantin emäsmuutos G > A sijaitsee 5′-silmukointialueella viisi nukleotidia alavirtaan eksonista 4. Kyseisen silmukointikohdan mutaation on havaittu häiritsevän esiaste-RNA:n normaalia silmukointia ja johtavan eksonin 4 ohittamiseen sekä apikaalisen ANO7-proteiinin ilmentymisen menettämiseen eturauhasen luminaalisessa epiteelissä. ANO7:n lähetti-RNA:n on havaittu jäävän silmukoinnin jälkeen tumaan epiteelisolujen sisään, mikä voisi selittää proteiinin ilmentymisen menettämisen.
Tässä tutkielmassa tutkin, onko ANO7:n rs77559646-variantin aiheuttamaa silmukointivirhettä mahdollista korjata muokatuilla spliseosomaalisilla U1- ja U6-snRNA:illa, jotka sitoutuvat 5′-silmukointikohtaan ja osallistuvat esiaste-RNA:n silmukointiin. Tutkimusta varten valmistettiin muokatut spliseosomaaliset U1- ja U6-snRNA-plasmidit kohdennetun mutageneesin avulla tekemällä yksi mutaatio (U1 mut 1- ja U6 mut 1 -plasmidit) ja kaksi mutaatiota (U1 mut 2- ja U6 mut 2 -plasmidit). U1 mut 1- ja U6 mut 1 -plasmidit sisälsivät C > U emäsmuutoksen silmukointikohdassa +5. U1 mut 2 -plasmidi sisälsi lisäksi U > G emäsmuutoksen ja U6 mut 2 -plasmidi A > G emäsmuutoksen silmukointikohdassa +4.
Silmukoinnin korjaamista tutkittiin minigeenien silmukointianalyysillä (engl. minigene splicing assay). Plasmidit transfektoitiin COS-7-soluihin, RNA eristettiin ja muunnettiin käänteistranskriptaasipolymeraasiketjureaktiolla cDNA:ksi. Lopuksi suoritettiin PCR ANO7-minigeenille spesifisillä alukkeilla ja PCR-tuotteet visualisoitiin agaroosigeelielektroforeesilla.
Muokkaamalla spliseosomaalisia U1- ja U6-snRNA:ita pyrittiin lisäämään snRNA:iden komplementaarisuutta ANO7:n rs77559646-variantin kanssa. Sitä kautta yritettiin korjata variantin aiheuttamaa silmukointivirhettä. Silmukointianalyysi osoitti, että kahdella mutaatiolla muokattu spliseosomaalinen U1-snRNA korjasi osittain rs77559646-variantin silmukointia. Tulokset eivät tukeneet sitä, että muokatulla spliseosomaalisella U6-snRNA:lla olisi vaikutusta silmukointiin. Prostate cancer (PCa) is the second most common cancer in men worldwide and it is one of the most heritable human cancers, genetic factors accounting for 57 % of the risk. The chromosomal region 2q37.3, which contains the ANO7 gene, has been identified as a strong risk locus for prostate cancer. The ANO7 rs77559646 variant is associated with aggressive prostate cancer. This variant causes a G > A transition located at the 5′ splice region, five nucleotides downstream of exon 4. The change disrupts normal RNA splicing and causes skipping of exon 4, leading to loss of ANO7 protein expression in the prostate luminal epithelium. The aberrantly spliced ANO7 mRNA is retained in the nucleus, which might explain the loss of ANO7 protein.
This thesis investigated whether the splicing defect caused by the ANO7 rs77559646 could be corrected using modified U1 and U6 small nuclear RNAs (snRNAs), which are key components of the spliceosome. Modified U1 and U6 snRNA plasmids were generated through site-directed mutagenesis, introducing either a single mutation (U1 mut 1 and U6 mut 1) or two mutations (U1 mut 2 and U6 mut 2). The U1 mut 1 and U6 mut 1 plasmids contained a C > U substitution at the +5 position of the splice site. Additionally, the U1 mut 2 plasmid included a U > G substitution, while the U6 mut 2 plasmid carried an A > G substitution at the +4 position of the splice site.
Splicing efficacy was evaluated using a minigene splicing assay. Plasmids were transfected into COS-7 cells, followed by RNA isolation and reverse transcription into cDNA. PCR was then performed to amplify ANO7 minigene transcripts representing exon 4 inclusion or skipping, and the products were analyzed by agarose gel electrophoresis.
The modifications introduced into U1 and U6 snRNAs were designed to enhance their complementarity to the ANO7 rs77559646 variant and thereby promote correction of the splicing defect caused by the mutation. Splicing analysis revealed that the U1 snRNA containing two specific mutations partially corrected the aberrant splicing associated with rs77559646 variant. In contrast, the modified U6 snRNA showed no detectable effect on splicing.
Tässä tutkielmassa tutkin, onko ANO7:n rs77559646-variantin aiheuttamaa silmukointivirhettä mahdollista korjata muokatuilla spliseosomaalisilla U1- ja U6-snRNA:illa, jotka sitoutuvat 5′-silmukointikohtaan ja osallistuvat esiaste-RNA:n silmukointiin. Tutkimusta varten valmistettiin muokatut spliseosomaaliset U1- ja U6-snRNA-plasmidit kohdennetun mutageneesin avulla tekemällä yksi mutaatio (U1 mut 1- ja U6 mut 1 -plasmidit) ja kaksi mutaatiota (U1 mut 2- ja U6 mut 2 -plasmidit). U1 mut 1- ja U6 mut 1 -plasmidit sisälsivät C > U emäsmuutoksen silmukointikohdassa +5. U1 mut 2 -plasmidi sisälsi lisäksi U > G emäsmuutoksen ja U6 mut 2 -plasmidi A > G emäsmuutoksen silmukointikohdassa +4.
Silmukoinnin korjaamista tutkittiin minigeenien silmukointianalyysillä (engl. minigene splicing assay). Plasmidit transfektoitiin COS-7-soluihin, RNA eristettiin ja muunnettiin käänteistranskriptaasipolymeraasiketjureaktiolla cDNA:ksi. Lopuksi suoritettiin PCR ANO7-minigeenille spesifisillä alukkeilla ja PCR-tuotteet visualisoitiin agaroosigeelielektroforeesilla.
Muokkaamalla spliseosomaalisia U1- ja U6-snRNA:ita pyrittiin lisäämään snRNA:iden komplementaarisuutta ANO7:n rs77559646-variantin kanssa. Sitä kautta yritettiin korjata variantin aiheuttamaa silmukointivirhettä. Silmukointianalyysi osoitti, että kahdella mutaatiolla muokattu spliseosomaalinen U1-snRNA korjasi osittain rs77559646-variantin silmukointia. Tulokset eivät tukeneet sitä, että muokatulla spliseosomaalisella U6-snRNA:lla olisi vaikutusta silmukointiin.
This thesis investigated whether the splicing defect caused by the ANO7 rs77559646 could be corrected using modified U1 and U6 small nuclear RNAs (snRNAs), which are key components of the spliceosome. Modified U1 and U6 snRNA plasmids were generated through site-directed mutagenesis, introducing either a single mutation (U1 mut 1 and U6 mut 1) or two mutations (U1 mut 2 and U6 mut 2). The U1 mut 1 and U6 mut 1 plasmids contained a C > U substitution at the +5 position of the splice site. Additionally, the U1 mut 2 plasmid included a U > G substitution, while the U6 mut 2 plasmid carried an A > G substitution at the +4 position of the splice site.
Splicing efficacy was evaluated using a minigene splicing assay. Plasmids were transfected into COS-7 cells, followed by RNA isolation and reverse transcription into cDNA. PCR was then performed to amplify ANO7 minigene transcripts representing exon 4 inclusion or skipping, and the products were analyzed by agarose gel electrophoresis.
The modifications introduced into U1 and U6 snRNAs were designed to enhance their complementarity to the ANO7 rs77559646 variant and thereby promote correction of the splicing defect caused by the mutation. Splicing analysis revealed that the U1 snRNA containing two specific mutations partially corrected the aberrant splicing associated with rs77559646 variant. In contrast, the modified U6 snRNA showed no detectable effect on splicing.