Pikornavirusten käyttö geenivektoreina ja syöpäterapiassa sekä Coxsackievirus A7 -isolaattien sekvenssianalyysi
Ylä-Pelto, Jani (2012-07-09)
Pikornavirusten käyttö geenivektoreina ja syöpäterapiassa sekä Coxsackievirus A7 -isolaattien sekvenssianalyysi
Ylä-Pelto, Jani
(09.07.2012)
Turun yliopisto
avoin
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201207096187
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201207096187
Kuvaus
Siirretty Doriasta
Tiivistelmä
Kirjallisessa osassa tarkasteltiin pikornavirusten käyttöä geenivektoreina ja
syöpäterapiassa. Pikornavirukset ovat positiivissäikeisiä RNA-viruksia, ja niiden
genomi koostuu rakenteellisista kuoriproteiineista VP1-VP4 sekä ei-rakenteellisista
proteiineista 2A-2C ja 3A-3D. Geenivektoritutkimukset ovat keskittyneet erilaisten
inserttien kloonaamiseen virusten VP1-VP4-alueelle ja genomin 5'-päähän sekä näiden
muutosten vaikutusten seuraamiseen virusten elinkierrossa solu- ja hiirimalleissa.
Geenivektoreina on parhaiten toimineet coxsackievirukset B3, B4 ja A9 sekä mengo- ja
poliovirus. Niitä on käytetty hiirissä mm. neuronien motorisen BDNF-reseptorin
ilmentämiseen sekä hiiren interleukiini-10:n tuottamiseen selkäydinkanavan vaurioiden
korjaamiseksi. Syöpäterapiatutkimuksissa on saatu lupaavia tuloksia coxsackieviruksilla
A21, A13, A15 ja A18 sekä echo-, Seneca Valley 001- ja EMCV-viruksilla. Viruksilla
on saatu mm. rintasyövän pääkasvain ja metastasoituneet etäpesäkkeet häviämään sekä
eturauhassyövän kasvaimia pienenemään. Seneca Valley 001 -virus on osoittautunut
tehokkaaksi syöpiä vastaan, joilla on neuroendokriinisiä ominaisuuksia. Viruksen
käyttämistä faasi 2:n kliinisiin kokeisiin ollaan parhaillaan suunnittelemassa
pienisoluisen keuhkosyövän ja lasten neuroendokriinisen syövän kohdalla.
Kokeellisessa osassa optimoitiin RT-PCR-menetelmä coxsackievirus A7:n (CV-A7)
genomin tuottamiseksi PCR-reaktiolla (FL-PCR). FL-PCR:n optimointi tehtiin
vektoreilla, joihin oli kloonattu CV-A7-USSR- (USSR-pcDNA3) ja CV-A7-Parkerisolaattien
(Parker-TA) genomit. Menetelmää käytettiin myöhemmin muiden CV-A7-
virusisolaattien (275/58, ET1080 ja SVK) tutkimiseen. Näistä isolaateista eristettiin
virus-RNA, joka käännettiin cDNA:ksi RT-entsyymillä. PCR:ssä käytetyt, CV-A7-
spesifiset koettimet oli suunniteltu aiemmin sekvensoidun CV-A7-sekvenssin
(GenBank AY421765) pohjalta. Infektiivisen kloonin tuottamiseksi USSR-pcDNA3- ja
Parker-TA-vektoreista tuotettiin PCR:n avulla (T7-PCR) virusgenomin sisältävä DNAjakso,
jonka 5'-päähän muodostui alukkeiden avulla T7RNA-polymeraasipromoottori ja
3'-päähän polyA-häntä. Työssä myös sekvensoitiin ja analysoitiin CV-A7-virusisolaatit
Parker, USSR, 275/58, ET1080 ja SVK sekä kloonattiin täyspitkiä virusgenomeja
cDNA-muodossa mutaatiokokeita varten.
FL-PCR:n optimointi onnistui, ja neljä viidestä CV-A7-isolaatista sekvensoitiin.
Virusgenomien pituus vaihteli 7403–7405 nt:n välillä. CV-A7-ET1080, -Parker ja -
USSR osoittautuivat yli 99 % ja CV-A7-275/58 82,6 % nt samankaltaisiksi koko
genomin pituudelta AY421765:en suhteen. Yksittäisten geenien ja proteiinien osalta
CV-A7-275/58 oli 75,8–90,4 % nt ja 93,7–98,8 % aa samankaltainen muiden suhteen.
Simplot-analyysissä 3B-geenialue oli heterogeenisin. CV-A7-SVK-isolaatti osoittautui
echovirus kolmeksi. Infektiivistä kloonia ei saatu tuotettua T7-PCR-tuotteista.
syöpäterapiassa. Pikornavirukset ovat positiivissäikeisiä RNA-viruksia, ja niiden
genomi koostuu rakenteellisista kuoriproteiineista VP1-VP4 sekä ei-rakenteellisista
proteiineista 2A-2C ja 3A-3D. Geenivektoritutkimukset ovat keskittyneet erilaisten
inserttien kloonaamiseen virusten VP1-VP4-alueelle ja genomin 5'-päähän sekä näiden
muutosten vaikutusten seuraamiseen virusten elinkierrossa solu- ja hiirimalleissa.
Geenivektoreina on parhaiten toimineet coxsackievirukset B3, B4 ja A9 sekä mengo- ja
poliovirus. Niitä on käytetty hiirissä mm. neuronien motorisen BDNF-reseptorin
ilmentämiseen sekä hiiren interleukiini-10:n tuottamiseen selkäydinkanavan vaurioiden
korjaamiseksi. Syöpäterapiatutkimuksissa on saatu lupaavia tuloksia coxsackieviruksilla
A21, A13, A15 ja A18 sekä echo-, Seneca Valley 001- ja EMCV-viruksilla. Viruksilla
on saatu mm. rintasyövän pääkasvain ja metastasoituneet etäpesäkkeet häviämään sekä
eturauhassyövän kasvaimia pienenemään. Seneca Valley 001 -virus on osoittautunut
tehokkaaksi syöpiä vastaan, joilla on neuroendokriinisiä ominaisuuksia. Viruksen
käyttämistä faasi 2:n kliinisiin kokeisiin ollaan parhaillaan suunnittelemassa
pienisoluisen keuhkosyövän ja lasten neuroendokriinisen syövän kohdalla.
Kokeellisessa osassa optimoitiin RT-PCR-menetelmä coxsackievirus A7:n (CV-A7)
genomin tuottamiseksi PCR-reaktiolla (FL-PCR). FL-PCR:n optimointi tehtiin
vektoreilla, joihin oli kloonattu CV-A7-USSR- (USSR-pcDNA3) ja CV-A7-Parkerisolaattien
(Parker-TA) genomit. Menetelmää käytettiin myöhemmin muiden CV-A7-
virusisolaattien (275/58, ET1080 ja SVK) tutkimiseen. Näistä isolaateista eristettiin
virus-RNA, joka käännettiin cDNA:ksi RT-entsyymillä. PCR:ssä käytetyt, CV-A7-
spesifiset koettimet oli suunniteltu aiemmin sekvensoidun CV-A7-sekvenssin
(GenBank AY421765) pohjalta. Infektiivisen kloonin tuottamiseksi USSR-pcDNA3- ja
Parker-TA-vektoreista tuotettiin PCR:n avulla (T7-PCR) virusgenomin sisältävä DNAjakso,
jonka 5'-päähän muodostui alukkeiden avulla T7RNA-polymeraasipromoottori ja
3'-päähän polyA-häntä. Työssä myös sekvensoitiin ja analysoitiin CV-A7-virusisolaatit
Parker, USSR, 275/58, ET1080 ja SVK sekä kloonattiin täyspitkiä virusgenomeja
cDNA-muodossa mutaatiokokeita varten.
FL-PCR:n optimointi onnistui, ja neljä viidestä CV-A7-isolaatista sekvensoitiin.
Virusgenomien pituus vaihteli 7403–7405 nt:n välillä. CV-A7-ET1080, -Parker ja -
USSR osoittautuivat yli 99 % ja CV-A7-275/58 82,6 % nt samankaltaisiksi koko
genomin pituudelta AY421765:en suhteen. Yksittäisten geenien ja proteiinien osalta
CV-A7-275/58 oli 75,8–90,4 % nt ja 93,7–98,8 % aa samankaltainen muiden suhteen.
Simplot-analyysissä 3B-geenialue oli heterogeenisin. CV-A7-SVK-isolaatti osoittautui
echovirus kolmeksi. Infektiivistä kloonia ei saatu tuotettua T7-PCR-tuotteista.