RNA-polymeraasi I:n transkription aloitus yksittäismolekyylitasolla

Abstract

DNA:sta tuotetaan RNA:ta transkriptiossa ja tuotetusta RNA:sta tuotetaan muun muassa proteiineja. RNA:n tuottamisesta ovat vastuussa RNA-polymeraaseiksi kutsutut entsyymit. Eukaryooteilla on kolme RNA-polymeraasia, joista ribosomaalista RNA:ta tuottaa RNA-polymeraasi I. RNA-polymeraasi I:n yksityiskohtainen toimintamekanismi on vielä puutteellisesti tunnettua. Erityisesti RNA-polymeraasi I:n transkription aloituskompleksin muodostumisen dynamiikka on vielä pitkälti selvittämättä. RNA-polymeraasi I vaatii avustavia proteiineja, jotta se voi sitoutua promoottoriinsa ja aloittaa transkription. RRN3:n ja CF:n avulla RNA-polymeraasi I muodostaa minimaalisen transkription aloituskompleksin. TBP ja UAF täydentävät minimaalisen transkription aloituskompleksin ja lisäävät sen transkriptioaktiivisuutta kymmenkertaisesti. Vielä ei tiedetä, missä järjestyksessä nämä proteiinit sitoutuvat promoottorille ja onko sitoutuminen dynaamista vai vakautuuko syntynyt kompleksi promoottorin ympärille. RNA-polymeraasin I:n aloituskompleksin sitoutumista DNA:han tutkittiin aluksi elektroforeettisella siirtymäkokeella sekä anisotropiakokeella. Näitä tuloksia pidettiin kuitenkin kvalitatiivisina ja erittäin paljon vaikeasti puhdistettavia proteiineja kuluttavana. Nämä kokeet eivät myöskään ole reaaliaikaisia, minkä takia dynaaminen informaatio oli hyvin rajallista. Näin ollen siirryttiin käyttämään yksittäisten molekyylien fluoresenssimikroskopiaan perustuvaa tutkimusmenetelmää, mikä mahdollisti DNA‒proteiinikompleksin muodostumisen seuraamisen reaaliajassa. Tämä kuitenkin vaatii kokeissa käytettyjen proteiinien leimaamista ja huomattavan määrän data-analyysimenetelmien kehittämistä. Tulosten mukaan RRN3 ei yksinään sitoudu DNA:han, CF ja RNA-polymeraasi I yksinään sitoutuvat promoottoriin dynaamisesti kahdella tavalla muodostaen joko lyhyt- tai pitkäikäisen kompleksin DNA:n kanssa. RNA-polymeraasi I:n, RRN3:n ja CF:n yhdessä muodostaman minimaalisen transkription aloituskompleksin sitoutuminen on myös olevan kaksivaiheista. Alustavien tulosten mukaan UAF ja TBP vakauttavat CF:n sitoutumista promoottoriin täydellisessä transkription aloituskompleksissa. Luotujen menetelmien ja saatujen tulosten avulla on RNA-polymeraasi I:n aloituskompleksin sitoutumisjärjestys promoottorille mahdollista selvittää jatkotutkimuksissa.