Rekombinanttiproteiinien affiniteettipuhdistus geeniteknisesti lisättyjen peptidien ja domeenien avulla — alan uusimmat innovaatiot

Abstract

Affiniteettipuhdistus on yli vuosisadan vanha biologisiin vuorovaikutuksiin perustuva proteiinien puhdistus- ja eristysmenetelmä. Yhdistelmä-DNA-tekniikoiden kehittäminen on mullistanut proteiinien affiniteettipuhdistuksen mahdollistamalla ligandiin sitoutuvan peptiditagin lisäämisen tuoteproteiiniin. Tässä tutkielmassa tutustutaan neljään yleiseen geeniteknisesti lisättyjä peptiditageja ja domeeneja hyödyntävään affiniteettipuhdistusratkaisuun sekä perehdytään uusiin innovaatioihin, joissa korostuvat ympäristöystävällisyys, edullisuus sekä mahdollisuus yleismenetelmän kehitykselle. Rekombinanttiproteiinien affiniteettipuhdistuksessa tuoteproteiini sitoutuu geeniteknisesti lisätyn peptiditagin tai proteiinidomeenin avulla spesifisesti stationäärifaasiin sidottuun ligandiin ja lopuksi se eluoidaan irti ligandista eluutiopuskurilla. Yleisin peptiditagi on kuudesta histidiiniaminohaposta koostuva histagi (engl. His-tag), jota ei pienen koon ja varauksen takia tyypillisesti tarvitse poistaa lopullisesta tuotteesta. Histidiinirikkaat kontaminoivat proteiinit kuitenkin laskevat tuotteen puhtausprosenttia. Strep II on toinen yleisesti käytetty pieni peptiditagi, jonka avulla tuoteproteiinia pystytään puhdistamaan tehokkaasti. Suurikokoisista proteiinidomeeneista yleisimpiin lukeutuvat maltoosia sitova proteiini (engl. maltose binding protein, MBP) ja glutationi-S-transferaasi (engl. glutathione-S-transferase, GST). Niiden käytön haasteena on domeenin poistaminen tuoteproteiinista. Uusia innovatiivisia matriisiratkaisuja ovat suodatinpaperi selluloosaa sitovan domeenin (engl. cellulose binding domain, CBD) sisältäville rekombinanttiproteiineille sekä kitosaani ja silikaatti histidiinihännällisille proteiineille. Suodatinpaperin käyttöä rajoittaa puhdistettavan proteiinin koko, mutta etenkin silikaatti vaikuttaa lupaavalta matriisivaihtoehdolta. Myös uusia inteiinipohjaisia eli itsestään silmukoituvia peptidikomponentteja hyödyntäviä innovaatioita on kehitetty. Split-inteiinipohjaiset kaupallistetut affiniteettipuhdistusratkaisut iCapTag ja Cytiva Protein Select mahdollistavat natiivimuotoisen tuoteproteiinin tuottamisen ja Cytiva Protein Select:stä poikkeuksellisen tekee se, että tuoteproteiinin irrottaminen inteiinistä ei vaadi pH:n muutosta. Yksikään innovaatioista ei vielä toistaiseksi tarjoa ratkaisua universaalin ja kestävän affiniteettipuhdistusmenetelmän toteuttamiseen. Uusia innovaatioita tarvitaan siis yhä. Suurin potentiaali lienee kuitenkin inteiinipohjaisilla ratkaisuilla, jotka mahdollistavat natiivimuotoisen tuoteproteiinin osana puhdistusprosessia.