siRNA-pallonukleiinihappojen synteesi ja karakterisointi
avoin
Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.
Lataukset272
Pysyvä osoite
Verkkojulkaisu
DOI
Tiivistelmä
Iän myötä tapahtuva silmänpohjan rappeutuminen on yksi merkittävä sokeutumiseen johtava tekijä. Silmärappeumataudin patogeneesi on tuntematon, mutta sen taustalla tiedetään olevan silmän RPE retinal pigment epithelium) -solujen ilmentämät pro-inflammatoriset geenit. Itä-Suomen yliopistossa on tutkittu GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) -geeniä hiljentävää siRNA:ta (small interfering RNA). RPE-solumallilla tehdyistä solukokeista on saatu lupaavia tuloksia, mutta paljaat siRNA-juosteet kulkeutuivat soluihin heikosti. siRNA-juosteiden pakkaaminen pallonukleiinihapon muotoon lisää niiden solukuljetusta ja pysyvyyttä. Tämän työn tarkoitus on syntetisoida ja karakterisoida erilaisia GAPDH-siRNA:n sisältäviä pallonukleiinihappoja ja niiden kolesterolikonjugaatteja sekä selvittää, miten erilaiset pallorakenteet vaikuttavat siRNA:n ominaisuuksiin.
Tässä työssä valmistettiin kolme erilaista pallonukleiinihappoa käyttäen keskusrakenteina atisidimodifioitua [C60]-fullereenia ja polyoktaedrista silseskvioksaania (POSS). Pallonukleiinihappojen valmistusta varten aminomodifioituun leimattomaan ja leimattuun sense-juosteeseen konjugoitiin bisyklononyyni (BCN) sekä antisense-juosteeseen kolesteroli. Sense-juosteet liitetiin keskusrakenteisiin rengasjännityksen tehostamalla alkyyni–atsidi-sykloadditiolla (SPAAC). Pallonukleiinihappoja hybridisoitiin antisense-juosteen ja sen kolesterolikonjugaatin seoksilla. Valmiit pallonukleiinihapot karakterisoitiin PAGE:lla (poly acryl amide gel electrophoresis), SEC-MALS:illa (Size-exclusion chormatography–multiple angle light scattering), sulamislämpötilamittauksin ja DLS:llä (dynamic light scattering). Lisäksi valmistettuja pallonukleiinihappoja lähetettiin Itä-Suomen yliopistoon RPE-solumallissa tutkittaviksi.
Kaikki halutut pallonukleiinihapot onnistuttiin valmistamaan ja käytetyt menetelmät soveltuivat hyvin sekä pallonukleiinihappojen synteesiin että niiden karakterisointiin. Tehdyt solukokeet osoittivat [C60]-fullereenipallonukleiinihappojen hiljentävän GAPDH-geenin ilmennystä huomattavasti paljasta siRNA:ta paremmin. Fluoreskeiinileimaus ja kolesterolikonjugaatio eivät häirinneet geenin hiljennystä. POSS-ydin näyttäisi olevan [C60]-fullereeniydintä parempi keskusrakenne. POSS-pallonukleiinihapon synteesi onnistui yhtä hyvin, ellei paremminkin, kuin [C60]-fullereenipallonukleiinihapolla. Lisäksi saatu tuote oli homogeenisempi.
Pallonukleiinihapot ovat hyvä solukuljetin silmänpohjan ikärappeumaan kohdennetulle GAPDH-siRNA:lle. Lisäksi biohajoava ja bioyhteensopiva POSS-keskusrakenne voisi olla [C60]-fullereenin ekologisesti kestävämpi korvaaja. Tulevaisuudessa pallonukleiinihappoja voitaisiin pakata solunulkoisiin vesikkeleihin solukuljetuksen parantamiseksi edelleen.