Ligaatiopohjaisen Geno1-menetelmän kehitys ja optimointi puhdistamattomille näytteille

Abstract

Joka kuudes maailmassa tapahtuva kuolema on syövän aiheuttama ja syövän varhaisella havaitsemisella on huomattu olevan merkittävä vaikutus taudista selviytymiseen. Syöpäsoluista vapautuu DNA:ta nekroosin, erityksen ja apoptoosin välityksellä. Tätä solunulkoista DNA:ta voidaan käyttää merkkiaineena syövän havaitsemisessa sekä syöpämutaatioita tutkittaessa. Solunulkoisen DNA:n määrä on eri kehon nesteissä hyvin pieni, mikä tekee siitä haasteellisen merkkiaineen. Solunulkoisen DNA:n eristäminen nestebiopsianäytteestä magneettipartikkelien avulla on kuitenkin osoittautunut tehokkaaksi menetelmäksi. Tässä työssä kehitettiin DNA:n pyydystämismenetelmä, joka hyödyntää magneettipartikkeleja sekä Geno1-teknologiaa ja kykenee puhdistamaan kohdemolekyylin suoraan puhdistamattomasta virtsa- tai sylkinäytteestä.

Solunulkoisen DNA:n sitoutuminen perustuu sitoutumisreaktioon ensin biotiinia sisältävän Geno1-koettimen kanssa, minkä jälkeen kohdemolekyylikompleksi sitoutuu streptavidiinilla päällystettyihin magneettipartikkeleihin. Ennen sitoutumista suoritetaan minimaalinen esikäsittely lämmön ja sentrifugoinnin avulla. Eristetty kohdemolekyylikompleksi muutetaan kaksijuosteiseksi molekyyliksi, johon on liitetty sekvensointikirjaston luomista varten tarvittavat alukkeet. Kirjastot sekvensoidaan kohdemolekyylien mutaatioiden havaitsemiseksi.

Kehitetty menetelmä tunnisti kaikki mutaatiot 100 %:n analyyttisellä tarkkuudella. Alin havaittu kohdemolekyylipitoisuus oli 20 amol. Menetelmä skaalautui kaikille näytetilavuuksille 50 ml:an asti ja menetelmä tunnisti kohdemolekyylit sekä virtsa- että sylkinäytteistä. Skaalautuvalla ja tarkalla menetelmällä on laajat käyttömahdollisuudet myös syöpädiagnostiikan ulkopuolella, kuten mikrobidiagnostiikassa.