Spektrofotometrinen kokonaistoksisuusanalyysi Escherichia coli biosensorilla.

Abstract

Kemikaalien toksisten vaikutusten arvioiminen, varsinkin niiden yhteisvaikutusten mittaaminen, on hyvin haasteellista. Tässä työssä koe-eläimiä korvaamaan käytettiin Escherichia coli K-12 (pEGFPluxABCDEamp) biosensoria. Perinteisesti optisen tiheyden avulla on tappokokeissa mitattu solujen määrä, mutta menetelmä ei erottele eläviä tai kuolleita soluja. Bioluminesenssi on riippuvainen rasva-aldehydien hapettumisesta rasvahapoiksi, joten se mittaa elävissä soluissa tapahtuvan rasva-aineenvaihdunnan määrää.

EGFP (enhanced green fluorescent protein) on fluoresoiva proteiini, joka ei tarvitse lisättyä substraattia toimiakseen. Fluoresenssi kertoo muodostuneen proteiinin määrän. Tiosyanaatti on tärkeä syanidimyrkytyksen indikaattori ja osa immuunijärjestelmää. Ilmavirran mukana kulkeutuvat lukuisat myrkyt ovat potentiaalinen terveydellinen ongelma.

E. coli -solujen kasvu ei ollut päivästä toiseen täsmälleen samanlaista. Tämä ongelma ratkaistiin kasvattamalla bakteerit yhdessä kasvatuksessa ja jakamalla ne tappokokeita varten. Ravinneliuoksen suuren taustafluoresenssin takia täytyi bakteerimassa puhdistaa ravinneliuoksesta ennen fluoresenssin mittausta. Lisäksi ilmavirran mukana kulkeutuville myrkyille ja tiosyanaatille kehitettiin mittaus menetelmiä.

Tutkimuksessa todettiin, että luminesenssi oli herkin mittaustapa. Osalle mitatuista yhdisteistä ei soveltunut vain luminesenssiin perustuva mittaus. Lähtökohtaisesti yhdistämällä mittausmenetelmiä saadaan enemmän informaatiota solujen toiminnasta, kuin millään yksittäisellä mittausmenetelmällä. Tutkimuksessa havaittiin eroja kasvufaasissa ja stationäärifaasissa olevien bakteerien herkkyydelle eri myrkkyjä kohtaan.

Fluoresenssi osoittautui toimivaksi tavaksi arvioida liuottimen vaikutusta, joskin työläämmäksi kuin bioluminesenssi tai optisen tiheyden mittaaminen. Tutkimuksessa onnistuttiin kehittämään kvalitatiivinen testi tiosyanaatille sekä seeruminäytteestä. että bakteerikasvatuksesta. Tutkimuksessa kehitettiin myös Ilmavirran mukana kulkeutuvien myrkkyjen spektrofotometrinen kokonaistoksisuus mittausta, millä saatiin havaittua ilmassa kulkeutuvia myrkyllisiä yhdisteitä. Mittalaitteen valmistaminen in situ -mittaukseen olisi seuraava looginen askel eteenpäin.