σ54-välitteisen transkription initiaatio ja Synechocystis sp. PCC6803

Abstract

Sigmafaktorien tehtävä on tunnistaa promoottori ja avustaa RNA polymeraasia (RNAP) transkription aloituksessa. Bakteereilla on useita sigmafaktoreita, jotka säätelevät eri geenien ekspressiota. Sigmafaktorit jaetaan σ70 ja σ54-perheisiin ja ne eroavat toisistaan niin rakenteeltaan kuin toiminnaltaan. σ70-RNAP-holoentsyymi isomerisoituu spontaanisti transkriptioon kykeneväksi kompleksiksi, kun taas σ54-RNAP vaatii ATP:ta hydrolysoivan aktivaattoriproteiinin ja DNA:ta taivuttavia avustavia tekijöitä. σ70 ja σ54-perheiden promoottorialueet ovat myös hyvin erilaiset. Syanobakteereilla ei ole löydetty σ54:ää, vaikka se tavataan useimmilla bakteerilajeilta. Syanobakteerien RNAP poikkeaa muiden bakteerien RNAP:sta, ja ei tiedetä kykeneekö σ54 muodostamaan transkription aloittavan kompleksin syanobakteerien RNAP:n kanssa.

Syanobakteerin RNAP:n ja σ54:n välisen vuorovaikutuksen tutkimista varten suunniteltiin ja rakennettiin Synechocystis sp. PCC6803 (tästedes Synechocystis)-kanta, johon oli siirretty synteettinen sigma54-operoni sisältäen Escherichia colin σ54 (rpoN), σ54-aktivaattorin, PspF:n, ja DNA:n taipumista avustava proteiinin IHF:n geenit. Tehokasta ja kasvatusolosuhteilla säädeltävää indusointia varten operonin edessä oli kuumalla (PsigB) tai kirkaalla valolla (PsigD) indusoituva syanobakteeripromoottori. Samaan Synechocystis–kantaan siirrettiin myös bakteerilusiferaasin geenit (luxCDABE) E. colin σ54 -spesifisen promoottorin Ppsp alaisuuteen, jolloin bioluminesenssia mittaamalla voitiin selvittää aktivoiko σ54-RNAP-holoentsyymi transkription syanobakteereilla. Lisäksi Synechocystiksen promoottereita tutkittiin siirtämällä luxCDABE promoottorien PsigB ja PsigD. alaisuuteen.

Synechocystiksen promoottorin PsigD havaittiin indusoituvan kirkkaassa valossa, jossa reportterigeenin tuottama luminesenssi kasvoi nelinkertaiseksi standardiolosuhteisiin verrattuna. PsigB indusoitui kuumassa valossa, mutta reportterigeenin tuottaman bioluminesenssin kasvu oli vähäisempää. Synechocystis-kanta, jossa on synteettinen sigma54-operoni PsigD:n alaisuudessa ja luxCDABE Ppsp:n alaisuudessa, saatiin luotua, ja sen toimintaa voidaan tutkia tulevaisuudessa.