Bispesifisen ankyriinitoistoproteiinin kehittäminen natiiviproteiinien ja -proteiinikompleksien kromatografiseen puhdistukseen
Ladataan...
suljettu
Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.
Pysyvä osoite
Verkkojulkaisu
DOI
Tiivistelmä
Tällä hetkellä käytössä olevat natiivien proteiinien puhdistusprosessit perustuvat monivaiheisiin kromatografiamenetelmiin, jotka voivat vaikuttaa negatiivisesti puhdistettavan proteiinin saantoon ja ominaisuuksiin. Tässä diplomityössä pyrittiin luomaan vaihtoehtoinen ratkaisu proteiinien puhdistukseen, tähdäten suoraviivaiseen, mutta hellävaraiseen puhdistusstrategiaan. Työssä keskiössä oli bispesifisen kytkinperiaatteella toimivan ankyriinitoistoproteiinin kehittäminen. Biotekniikassa hyödynnettävät ankyriinitoistoproteiinit ovat ihmisen suunnittelemia konsesussekvenssiin perustuvia molekyylejä, jotka tunnetaan paremmin nimellä darpiini (engl. designed ankyrin repeat protein, DARPin). Kytkinperiaatteella tarkoitetaan molekyylin kykyä sitoutua vain yhteen ligandiin kerrallaan. Fuusioproteiini suunniteltiin spesifiseksi kohdeproteiinille sekä eluenttina toimivalle GST-proteiinille siten, että sitoutumisaffiniteetti GST:tä kohtaan olisi huomattavasti suurempi kuin kohdeproteiinia kohtaan.
Työssä hyödynnettiin eri molekyylibiologian menetelmiä darpiinifuusioproteiinin rakentamiseen. Ankyriinitoistoproteiini koostuu 33 aminohapon pituisista motiiveista, jotka toistuvat rakenteessa peräkkäin muodostaen yhtenäisen sitomisrajapinnan antigeenille. Niimpä kaksi eri kohdetta sitovaa darpiinia voidaan geenitekniikan keinoin fuusioida saumattomasti yhteen muodostaen oikein laskostuvan proteiinifuusion. Sekvenssi kloonattiin faagivektoriin ja suotuisia klooneja selekoitiin faaginäyttötekniikalla. Selektiokokeet suunniteltiin niin, että ne suosisivat bispesifisiä kytkinperiaatteella toimivia darpiineja, joilla on suurempi affiniteetti GST-proteiinille kuin kohdeproteiinille. Faaginäytöllä rikastetut darpiinifuusiot kloonattiin ekspressiovektoriin ja yksittäisten kloonien sitoutumista kohdeantigeeneihin analysoitiin.
Sekvensointitulosten perusteella darpiinifuusiot saatiin onnistuneesti rakennettua. Rakennettujen ja selekoitujen darpiinidimeerien joukosta löydettiin klooni, joka sitoutuu spesifisesti sekä RPA43-kohdeproteiiniin että puhdistuksessa eluenttina käytettävään GST-proteiiniin. Antigeenien sitoutumiskohdat darpiinissa ovat osittain päällekäin, joten darpiini kykenee sitoutumaan vain yhteen antigeeniin kerrallaan. Tällaisen steerisen esteen myötä antigeenien välille syntyy kilpaileva sitoutumistilanne. Darpiini suosii sitoutumisinteraktiota GST-proteiinin kanssa, jota kohtaan darpiinilla on suurempi sitoutumisaffiniteetti. Kilpailevan sitoutumistilanteen ansiosta kromatografisen puhdistusprosessin eluutiovaiheessa GST kykenee syrjäyttämään RPA43:n ja darpiinin välisen sitoutumisinteraktion ja siten irrottamaan RPA43-proteiinin affiniteettipylväästä fysiologisessa pH:ssa.
Vaihtoehtoisten sitojien hyödyntäminen proteiinien puhdistuksessa kykenisi karsimaan tällä hetkellä käytössä oleviin tekniikoihin liittyviä rajoitteita, kuten liian ankarat eluutio-olosuhteet tai kohdeproteiinin geeniteknisen muokkauksen. Lopputuloksena saataisiin aikaisempaa suoraviivaisempi ja hellävaraisempi tapa puhdistaa natiiviproteiineja ja -proteiinikomplekseja.