Nukleaasit ja niiden aktiivisuuden in vitro -mittausmenetelmät

Abstract

Nukleaasit ovat entsyymejä, jotka pilkkovat nukleiinihappoja, kuten deoksiribonukleiinihappoa (DNA) ja ribonukleiinihappoa (RNA), hydrolysoimalla fosfodiesterisidoksia. Ne voidaan jakaa esimerkiksi endo- ja eksonukleaaseihin. Endonukleaasit pilkkovat keskeltä ketjua, ja eksonukleaasit joko 3’- tai 5’- päästä. Nukleaasit ovat keskeisiä perimän stabiloinnissa, immuunipuolustuksessa, apoptoosissa sekä DNA:n replikaatiossa, rekombinaatiossa ja korjauksessa. Niitä esiintyy kaikissa elämän domeeneissa. Monien nukleaasien rakenne tunnetaan, mutta niiden katalyyttinen mekanismi on epäselvä. Uudet löydöt laajentavat ymmärrystä näistä elintärkeistä entsyymeistä. Nukleaasien monimuotoisuuden takia niitä pystytään hyödyntämään esimerkiksi erilaisten sairauksien diagnostiikassa kehittämällä tarkempia ja herkempiä nukleiinihappokoettimia. Niiden katalyyttinen aktiivisuus voisi toimia diagnostisena biomarkkerina, mikä tarjoaisi mahdollisuuden uudentyyppisten määritysten kehittämiseen ja laajentaisi diagnostisia vaihtoehtoja. Nukleaasien aktiivisuus in vitro mitataan yleisimmin erotusvapaasti perustuen luminesenssiin, kuten nukleiinihappoihin sitoutuvilla leimoilla ja FRET-pohjaisilla menetelmillä. Esimerkiksi interkalaattorit, kuten väriaine PicoGreen, ovat nukleiinihappoihin sitoutuvia leimoja, jotka sitoutuvat DNA:n kaksoiskierteen väliin. Interkalaattorit pystyvät sitoutumaan vain kaksijuosteiseen DNA:han, minkä takia yksijuosteiseen DNA:han tai RNA:han sitoutuvia esimerkiksi fluoresenssipohjaisia koettimia on kehitetty. FRET-ilmiö perustuu energiansiirtoon virittyneen luovuttajamolekyylin ja perustilassa olevan vastaanottajamolekyylin välillä. HPLC, geelielektroforeesi ja elektrokemialliset menetelmät ovat erotukseen perustuvia standardimenetelmiä. Nykyisten mittausmenetelmien ongelmat edellyttävät nukleaasien tutkimuksen jatkamista tulevaisuudessa. Tämä mahdollistaa niiden entistä tehokkaamman hyödyntämisen esimerkiksi biomarkkereina ja genomin muokkauksessa. Tämä tutkielma käsittelee nukleaasien toimintaa, spesifisyyttä ja sovelluksia sekä niiden aktiivisuuden mittaamiseen käytettäviä in vitro -menetelmiä ja tulevaisuuden näkymiä. Tutkielmassa tarkastellaan erotukseen perustuvien ja erotusvapaiden menetelmien etuja ja haasteita sekä tutkitaan niiden tulevaisuuden näkymiä diagnostiikassa ja bioteknologisissa sovelluksissa.