Rokotteiden aiheuttamien vasta-aineiden monianalyytti-immunomääritys

Abstract

Rokotteet ovat hallittu tapa tuottaa elimistöön immuunivaste jollekin antigeenille. Nykyisissä rokoteohjelmissa erityisesti vastasyntyneiden suojaksi raskaana olevat saavat DTaP-rokoteboosterin, josta aiheutuvasta immunovasteesta osa siirtyy sikiölle istukan kautta IgG-vasta-aineina. Rokotteet sisältävät yhä enemmän komponentteja, jonka takia on tärkeää rokotteiden tehokkuuden ja vaikutuksen seuraamiseksi kehittää määrityksiä, jotka voivat samanaikaisesti mitata rokotuksesta aiheutuvia useita eri vasta-aineita potilailla. Tämän työn tarkoituksena oli luoda uusi 8-osainen immunomääritysprotokolla vasta-aineiden mittaamiseen käyttäen kaupallista Luminex-virtaussytometriä, jonka oli tarkoitus havaita vasta-aineita monista DTaP-rokotteista löytyvään hinkuyskä-, kurkkumätä-, jäykkäkouristustoksiiniin, pertaktiiniin, rihmamaiseen hemagglutiniiniadhesiiniin, hemofilus b:n pintasokeriin sekä negatiiviseksi kontrolliksi luonnollisista infektioista aiheutuvat adenylaattisyklaasitoksiinin ja vain joissain rokotteissa esiintyvän fimbriae 2 & 3:n vasta-aineet. Mitattavien vasta-aineiden antigeenit konjugoitiin magneettihelmien pinnalla oleviin karboksyyliryhmiin kovalenttisesti käyttämällä EDC-NHS-reaktiota. Helmen pinnalla olevaan antigeeniin sitoutuu näytteen vasta-aine, joka leimataan vuohen anti-human IgG:n ja fykoerythrinin kompleksilla. Magneettihelmiä on useita eri tyyppejä, jotka voidaan erottaa toisistaan niiden erilaisten sisäisten fluoresenssien avulla. Luminex-virtaussytometri mittaa näytekaivosta samanaikaisesti sekä sen sisältämät helmityypit ja laskee helmityypien pinnalle sitoutuneiden immunokompleksien keskiarvon. Tätä keskiarvoa verrattiin WHO:n refrenssinäytteestä saatuun standardikäyrään, josta pääteltiin tuntemattoman näytteen vasta-ainepitoisuus. Tuloksia verrattiin kahden laboratorion Luminex-määrityksien tuloksiin. Useat eri helmet eivät aiheuttaneet merkittävää häiriötä toisiinsa. Määritys pystyi kvantifioimaan antigeenistä riippuen yli 88 - 98% näytteistä yhden referenssilaboratorion tulosten perusteella, sekä kykeni osoittamaan kvantitatiivisesti vasta-aineiden kasvun rokotteen jälkeen kaikista kahdeksan antigeenin vasta-aineista. Määrityksellä saadut vasta-ainetasot korreloivat keskimääräisesti hyvin (R2 = 0,84 - 0,99) toisten laboratorioiden tulosten kanssa, mutta tuloksissa oli laboratoriokohtaista systemaattista ja antigeenikohtaista eroa. Määritysprotokollaa vielä validoidaan yhteistyössä Belgian valtiollisen kansanterveyslaitoksen kanssa referenssilaboratoriokäyttöön.