Kihokin naftokinonien LC-MS/MS-analytiikka : ioninmuodostus, rakenneisomeria ja fragmentaatiomekanismit

Abstract

Kihokit (Drosera) ovat lihansyöjäkasveja, joista erityisesti pyöreälehtikihokilla (D. rotundifolia) on pitkä historia perinteisessä lääketieteessä sen terapeuttisten ominaisuuksien vuoksi. Näiden vaikutusten on raportoitu liittyvän kasvin erikoistuneisiin metaboliitteihin, kuten flavonoideihin ja naftokinoneihin. Erityisesti naftokinonien on esitetty olevan vastuussa useista kasvin terapeuttisista vaikutuksista.

Luonnonvaraisten kihokkipopulaatioiden väheneminen sekä kasvin keräämisen työläys ovat lisänneet kiinnostusta kihokin kasvattamiseen kontrolloiduissa olosuhteissa. Kihokin kemiallisen koostumuksen, kuten naftokinonipitoisuuksien, on kuitenkin havaittu vaihtelevan kasvupaikan, kasvuolosuhteiden ja kihokkilajin mukaan. Tämän vuoksi tarvitaan luotettavia analyysimenetelmiä yksittäisten naftokinonien tunnistamiseen ja kvantifiointiin.

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää, miten analyysiolosuhteet vaikuttavat naftokinonien LC-MS-käyttäytymiseen sekä kehittää yhdistekohtaisia MRM-menetelmiä niiden tunnistamiseen ja kvantifiointiin kihokkiuutteista. Työssä käytettiin naftokinonistandardeja (plumbagiini ja jugloni) sekä laboratoriossa kasvatetusta kihokista valmistettuja uutteita, joiden analysointiin käytettiin UHPLC-DAD-MS/MS-laitteistoja. Naftokinonien käyttäytymistä tutkittiin sekä QqQ- että Orbitrap-laitteistoilla vertailemalla eri eluenttikoostumuksia ja ionisaatiotapoja. MRM-menetelmät kehitettiin QqQ-laitteistolla optimoimalla prekursori- ja tuoteionien kartiojännitteet ja törmäysenergiat. Kehitetyt menetelmät sisälsivät vähintään kaksi prekursori–tuoteioni-siirtymää, joiden valinnassa keskeistä oli käytettävien tuoteionien spesifisyys analysoitavaa yhdistettä kohtaan.

Tutkimuksessa saadut tulokset osoittavat, että ionisaatiotapa ja eluentin koostumus vaikuttivat merkittävästi naftokinonien ioninmuodostukseen sekä kromatografiaan niin standardinäytteessä kuin kihokkiuutteessa. Käytettäessä 0,1 % muurahaishappoa (B) ja asetonitriiliä (A) eluentteina havaittiin naftokinoneilla kaksi kromatografista piikkiä, joilla oli erilaiset UV-spektrit. Puolestaan, kun eluenttina käytettiin ultrapuhdasta Milli-Q-vettä (B) ja asetonitriiliä (A) havaittiin naftokinonit yhtenä kromatografisena piikkinä. Ionisaation osalta voitiin todeta, että naftokinonien ionisaatio on herkkä sekä laitteiston olosuhteille että näytteen ominaisuuksille.

Lisäksi juglonille, plumbagiinille ja kihokkiuutteessa olevalle plumbagiinin isomeerille kehitettiin ja validoitiin yhdistekohtaiset MRM-menetelmät käyttäen positiivista ionisaatiota ja toisena eluenttina ultrapuhdasta Milli-Q-vettä. Juglonille tehtiin kaksi MRM-menetelmää, joista toinen soveltui juglonin selektiiviseen tunnistamiseen ja kvantifiointiin, kun taas toinen mahdollisti myös mahdollisten isomeeristen yhdisteiden havaitsemisen. Plumbagiinin osalta merkittäväksi MRM-siirtymäksi osoittautui m/z 189 → m/z 121, jonka avulla plumbagiini voitiin erottaa sen isomeeristä ja tunnistaa kihokkiuutteesta.