Puolijohdetransistoripohjainen DNA-detektiotekniikka ja sen PCR-yhteensopivuus

Abstract

Nykyaikainen nukleiinihappodiagnostiikka tarvitsee yhä tehokkaampia määritysmenetelmiä, joiden avulla voitaisiin nopeasti ja luotettavasti havaita DNA:ta. Puolijohdetransistoreihin perustuva teknologia mahdollistaa reaaliaikaisen ja kvantitatiivisen DNA:n detektoinnin ilman kallisarvoista fluoresenssia mittaavaa mittalaitteistoa. Tässä työssä käytetyn kanavatransistoripohjaisen tekniikan periaate perustuu kohde-DNA:n sitoutumiseen transistorin hilan päälle immobilisoituun koetinkerrokseen. Negatiivisesti varautuneen kohde-DNA:n hybridisoituminen muuttaa sähköistä kenttää hilan ympärillä. Tämä puolestaan aiheuttaa muutoksen kanavatransistorin sähkönjohtavuudessa, mikä havaitaan sähköisenä vasteena. Matala ionikonsentraatio (1-5 mM) on välttämätöntä heikkojen varausmuutosten havaitsemisessa kanavatransistoripohjaisella detektiomekanismilla. Peptidinukleiinihapolla (engl. peptide nucleic acid, PNA) on varauksettomuuden ansiosta korkeampi hybridisaatioaffiniteetti alhaisissa ionipitoisuuksissa kuin DNA:lla, mikä parantaa sekvenssispesifisen detektion herkkyyttä. PNA-koetinkerroksen luontaista rakennetta ja DNA-hybridisaatioaffiniteettia tutkittiin leimattujen kohdeoligojen fluoresenssia mittaamalla. Koetinpinnan immobilisaatiotiheyttä säädettiin koetinoligojen prehybridisaation avulla. Sähköisen detektiotekniikan toimivuutta testattiin myös pH-muutosten aiheuttamien vasteiden avulla. Työssä myös tutkittiin PCR:n toimivuutta kanavatransistoripohjaisen detektion vaatimassa matalassa ionikonsentraatiossa. Tutkimuksessa osoitettiin fluoresenssimittausten avulla, että DNA-sensorin PNA-tunnistuskerros oli aktiivisessa konformaatiossa. Transistoriin perustuvan mittaustekniikan toimivuus osoitettiin havaitsemalla selkeä sähköinen vaste pH-mittauksissa ja DNA-kohteen hybridisaatio havaittiin sähköisenä signaalina. PCR-amplifikaatio toimi tehokkaasti pienillä ionipitoisuuksilla (1 mM), mikä mahdollistaa tulevaisuudessa leimavapaan sähköisen mittaustekniikan integroinnin nukleiinihappojen monistusreaktioon.