Signaalisekvenssit; CLN5 -proteiinin puhdistuksen optimointi ja seuranta kiteytystä varten

Abstract

Työn kirjallisuusosa perehtyi signaalisekvensseihin. Ne ovat osa solun viestintäkoneistoa, osallistuen eritettävien tai solukalvolle päätyvien proteiinien kuljetukseen. Kuljetukseen osallistuvat proteiinit kuten SRP, SR, Sec61 ja SPaasi on tunnistettu, ja niiden rakenteet on selvitetty. Signaalisekvenssien rooli proteiinien kohdistuksessa on havaittu olevan merkittävä, huolimatta saatavilla olevan tiedon tämänhetkisistä puutteista koko kuljetustien kartoituksessa. Tämän työn puitteissa on mahdollista todeta niiden olevan varmasti osa isompaa koneistoa, mutta todellinen kuva on monimutkaisempi kuin mitä tällä hetkellä osaamme sanoa.

Työn kokeellisessa osassa puhdistettiin CLN5 -proteiinia kiteytystä varten, sen rakenteen selvittämiseksi. Sen tiedetään olevan lysosomin glykoproteiini, mutta sen funktiota ei tunneta. CLN5 -proteiini oli tuotettu bakulovektorilla Sf9 -hyönteissoluissa. CLN5:n molemmissa päissä oli yksi häntä affiniteettikromatografioilla tapahtuvaa puhdistusta varten. Puhdistus viimeisteltiin geelisuodatuksella. Puhdistusta seurattiin western blot -menetelmällä, ja CLN5:n saannon arvioimiseksi pyrittiin optimoimaan tätä muistuttava dot blot -menetelmä. Havaittiin, että CLN5 puhdistuu hyvin sekä solulysaatista että mediumista, mutta geelisuodatus paljasti, että suuri osa proteiinista on aggregoituneessa muodossa. Puhdistusolosuhteiden muuntelu ei tuottanut toivottua parannusta proteiinin liukoisuuteen. Dot blot -menetelmän rajoitukset estivät CLN5:n pitoisuuden määrittämisen paremmin kuin western blot -menetelmällä.