Kliinisten näytteiden PCR-yhteensopiva konsentrointi

Abstract

Kliiniset näytteet sisältävät inhibiittoreita ja komponentteja, jotka häiritsevät polymeraasiketjureaktioon (PCR, engl. polymerase chain reaction) perustuvia diagnostisia määrityksiä. Vähäisen kohdepatogeenin määrän takia tulee näytettä usein konsentroida PCR-määrityksen herkkyyden parantamiseksi. Näytteen puhdistus ja konsentrointi vaativat joko bakteerin viljelyä tai usein kallista instrumentointia vaativaa, monimutkaista ja työlästä käsittelyä, jossa käytetään haitallisia PCR:ää inhiboivia reagensseja. Potilasläheisessä käytössä PCR-määrityksen tulee olla täysin automatisoitu tai sisältää vain vähän näytteen manuaalisia käsittelyvaiheita.

B-ryhmän streptokokki (Streptococcus agalactiae, engl. Group B Streptococcus, GBS) on yleisin vakavien infektioiden aiheuttaja vastasyntyneillä. Bakteeri voi siirtyä äidiltä lapselle synnytyksen aikana ja aiheuttaa vakavan infektion ensimmäisten elinpäivien aikana. GBS seulotaan raskausviikoilla 35−37 vagina-rektaalisivelynäytteestä, jota suositellaan rikastusviljeltävän ennen GBS-määritystä. Tuloksen mukaan äidille annetaan synnytyksen aikana antibioottihoitoa. Seulonnassa suositellaan siirryttäväksi suoraan sivelynäytteestä tehtävään synnytyksenaikaiseen ja potilasläheiseen nukleiinihappomääritykseen.

Diplomityön tavoitteena oli kartoittaa manuaalista ja PCR-yhteensopivaa kliinisten näytteiden konsentrointimenetelmää Abacus Diagnostica Oy:n GenomEra®-määritysalustalle. Työssä vertailtiin kaupallisia näytteen puhdistus- ja konsentrointisovelluksia. Parhaaksi arvioidulla sovelluksella suoritettiin toteutettavuustutkimus sen käytöstä suorien GBS-sivelynäytteiden käsittelyssä. Käsittelystä pyrittiin muokkaamaan mahdollisimman nopea ja yksinkertainen, jotta sitä voitaisiin käyttää potilasläheisessä GenomEra® GBS -testissä. Tutkimukseen valittiin DNA-eristysmenetelmä, joka perustuu pintavaraukseltaan pH-riippuvaisella ioninvaihtomatriisilla pinnoitettuihin paramagneettisiin partikkeleihin. Alhaisessa pH:ssa positiivisesti varautuneet partikkelit sitovat DNA:ta. DNA eluoidaan pH:ssa 8,5 partikkelien pintavarauksen neutraloituessa.

Työssä onnistuttiin kehittämään GenomEra®-määritysalustalle soveltuva näytteen käsittelymenetelmä, jolla näyte puhdistetaan ja konsentroidaan alle 10 minuutissa. Menetelmällä todettiin olevan potentiaalia suorien GBS-sivelynäytteiden käsittelyyn. Sen suurimpina etuina ovat vähäinen instrumentointitarve ja miedot PCR-yhteensopivat reagenssit. Manuaalisena menetelmänä se ei välttämättä sovellu suoraan potilasläheiseen ympäristöön, mutta se tarjoaa mahdollisuuden täysin automatisoidun näytteenkäsittelyn kehittämiseen GenomEra®-määritysalustalle tulevaisuudessa.