Assay development and study of a mutation affecting gonadotropin action
Pysyvä osoite
Verkkojulkaisu
DOI
Tiivistelmä
The gonadotropin action mediated via three glycoprotein hormones, luteinizing hormone (LH), chorionic gonadotropin (CG) and follicle-stimulating hormone (FSH) is paramount for sexual differentiation, pubertal development and reproductive functions. The gonadotropins bind to their respective receptors, luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor (LHCGR) and follicle stimulating hormone receptor (FSHR), both belonging to G protein-coupled receptor (GPCR) family. The stimulation of gonadotropin receptors with their respective ligand leads, among other signaling pathways, to the production of cyclic 3’,5’ adenosine monophosphate (cAMP) through GαS-mediated adenylyl cyclase activation. Modelling of patient mutations or those created using site-directed mutagenesis has been instrumental in understanding structural-functional relationship of key residues affecting gonadotropin action. The current thesis characterizes a novel inactivating mutation in LH beta subunit of a patient as well as the development of two methods that were utilized for its molecular characterization. The first method, REPLACR-mutagenesis (Recombineering of Ends of linearized PLAsmids after PCR), is a one-step site-directed mutagenesis method, that utilizes in vivo recombineering for mutagenesis (deletions, additions and substitutions) in plasmid vectors. REPLACR-mutagenesis is an inexpensive alternative to commercial kits involving fewer steps and with similar efficiency. The second method, named CANDLES (Cyclic AMP iNdirect Detection by Light Emission from Sensor cells), was developed to monitor the kinetics of cAMP generation in cell cultures, without transfection of any real-time cAMP sensor, which is especially difficult in primary cell cultures. Finally, the LH beta mutation that causes a lysine (Lys20) deletion resulting in a hypogonadal phenotype in the patient was molecularly characterized with the above-mentioned methods.
Menetelmäkehitys ja gonadotropiinien toimintaan vaikuttava mutaatio
Gonadotropiinivaikutus, jota välittää kolme hormonia, luteinisoiva hormoni (LH), follikkelia stimuloiva hormoni (FSH) ja istukkagonadotropiini (hCG), on keskeisen tärkeää sukupuolten erilaistumiselle, murrosiän aikaiselle kehitykselle sekä aikuisen lisääntymistoiminnoille. Gonadotropiinit sitoutuvat kohdesolujensa spesifisiin reseptoreihin, joita ovat luteinisoivan hormonin/istukkagonadotropiinin reseptori (LHCGR) ja follikkelia stimuloivan hormonin reseptori (FSHR); molemmat kuuluvat G-proteiineja sitovien reseptorien (GPCR) geeniperheeseen. Hormonin reseptoriin sitoutumisen aiheuttama stimulaatio saa aikaan syklisen adenosiini-3’,5’-monofosfaatin (cAMP) muodostumiseen GαS-proteiinin välityksellä ja adenylaattisyklaasientsyymin katalysoimana. Potilaista löydettyjen ja mutageneesillä tuotettujen mutaatioiden mallintaminen käyttäen kohdennettua mutageneesiä on ollut oleellisen tärkeää oppiessamme ymmärtämään molekyylien rakenne-funktio-yhteyksiä gonadotropiinivaikutuksen yhteydessä. Tässä väitöskirjatyössä esitellään uusi potilaan LH:n beta-alayksikön inaktivoiva mutaatio sekä kuvataan kaksi uutta menetelmää sen molekyylitason karakterisoimiseksi. Ensimmäinen menetelmä, REPLACR-mutageneesi (Recombineering of Ends of linearised PLAsmids after PCR), on yksivaiheinen kohdennetun mutageneesin menetelmä, jossa käytetään rekombinaatio (recombineering) -menetelmää pistemutaatioiden (poistot, lisäykset, korvaukset) aikaansaamiseksi plasmidivektorissa. REPLACR-mutageneesi on huokea vaihtoehto kaupallisille reagenssisarjoille, ja niihin verrattuna siinä on vähemmän välivaiheita tehokkuuden pysyessä samanlaisena. Toinen menetelmä, nimeltään CANDLES (Cyclic AMP iNdirect Detection by Light Emission from Sensor cells), kehitettiin mittaamaan soluviljelyjen kineettistä cAMP-vastetta ilman tarvetta transfektoida soluja reaaliaikaisella cAMP-sensorilla, mikä on erityisen vaikeaa primaarisoluilla. Lopuksi karakterisoimme hypogonadiselta potilaalta löydetyn lysiini-20:n (Lys20) deleetiosta johtuvan LH:n beta-ketjun inaktivoivan mutaation aiheuttamat molekyylitason muutokset hormonin toiminnassa.
Kuvaus
Siirretty Doriasta
Sarja
Turun yliopiston julkaisuja. Sarja D, Medica – Odontologica|1246
Saavutettavuusominaisuudet
Ei tietoa saavutettavuudesta