Rab24:n vuorovaikutus HOPS-kompleksin VPS18:n ja Golgin laitteen GM130:n kanssa

Abstract

Rab-proteiinit ovat eukaryoottien solunsisäistä kalvoliikennettä sääteleviä pieniä GTPaaseja. Rab24 osallistuu muun muassa autofagia- ja endosytoosireittien toiminnan sekä mitokondrioiden plastisuuden säätelyyn. Eniten Rab24:n toimintaa on tutkittu autofagiassa, eli prosessissa, jossa esimerkiksi tarpeettomia soluelimiä ja proteiineja hävitetään lysosomaalisesti. Rab24:n Q38P-mutaation on havaittu aiheuttavan koirien perinnöllisen neurodegeneratiivisen sairauden todennäköisesti autofagiaprosessin häiriöiden takia. Rab24 on erikoinen Rab-proteiini, sillä se hydrolysoi GTP:tä tavallista hitaammin. Tämä johtuu todennäköisesti epätavallisesta seriiniaminohappotähteestä (S67) hydrolyysin kannalta keskeisellä alueella. Rab24-S67L-mutantin tiedetään sitovan GTP:tä villityyppiä heikommin.

Rab24:n molekyylitason toiminta tunnetaan huonosti. Toiminnan selvittämiseksi on oleellista tunnistaa proteiineja, joiden kanssa se vuorovaikuttaa soluissa. Alustavan kartoituksen perusteella Rab24:n lähiympäristössä sijaitsee muun muassa HOPS-kompleksin proteiineja, esimerkiksi VPS18. HOPS-kompleksi säätelee autofagosomien ja endosomien fuusioitumista lysosomien kanssa. Rab24:n lähiympäristössä sijaitsee myös GM130 eli cis-Golgin laitteen markkeriproteiini, joka muun muassa säätelee kalvofuusioita Golgin laitteen alueella. Tutkielman tavoitteena oli selvittää, onko Rab24 fyysisessä vuorovaikutuksessa VPS18:n tai GM130:n kanssa. Lisäksi tutkittiin, ovatko fyysiset vuorovaikutukset riippuvaisia GTP:n sitoutumisesta Rab24:ään ja vaikuttavatko Rab24:n Q38P- ja S67L-mutaatiot vuorovaikutuksiin. Tutkielmassa selvitettiin myös Q38P- ja S67L-mutaatioiden vaikutusta Rab24:n kolokalisaatioon VPS18:n ja GM130:n kanssa.

Kaikki kokeet tehtiin hiiren Neuro-2a-neuroblastoomasoluilla. Fyysisiä vuorovaikutuksia tutkittiin koimmunopresipitaatiolla ja kolokalisaatiota proteiinien immunofluoresenssivärjäyksellä. Rab24:n ja VPS18:n vuorovaikutusta tutkittiin myös proksimiteettiligaatiomäärityksellä. Tutkielmassa Rab24:n ja VPS18:n välillä havaittiin fyysinen vuorovaikutus. Tulos viittaa siihen, että Rab24 vuorovaikuttaa HOPS-kompleksin kanssa, eli se saattaa osallistua tämän säätelemiin kalvofuusioihin. Rab24:n Q38P- ja S67L-mutaatiot heikensivät Rab24:n ja VPS18:n fyysistä vuorovaikutusta sekä kolokalisaatiota, mutta GTP:n sitoutumisen merkityksestä ei voitu tehdä johtopäätöksiä. Rab24:n ja GM130:n välillä ei havaittu fyysistä vuorovaikutusta, mutta Q38P-mutaatio paransi Rab24:n kolokalisaatiota GM130:n kanssa, eli se lisäsi Rab24:n paikantumista cis-Golgin laitteeseen.