Anti-nukleoproteiinivasta-aineen affiniteetin parantaminen geenitekniikan keinoin ja koronavirusmäärityksen kehittäminen kuoppalevyformaatissa

Abstract

Covid-19 diagnosoimiseksi on kehitetty antigeenitestejä. Ne ovat PCRmenetelmää nopeampia ja halvempia, mutta kärsivät usein alhaisesta herkkyydestä. Työssä tuotettiin ja paranneltiin vasta-aineita, jotta saavutettaisiin nopea, luotettava ja yksinkertainen testi. Faaginäyttötekniikalla rikastettiin vasta-ainekirjasto, joka kloonattiin pAK400 tuottovektoriin. Tuotot tehtiin 96 kuoppalevylle yksittäisinä klooneina. Tuotettujen Fab-kloonien sitomiskykyä tarkasteltiin ei-kilpailevalla immunomäärityksellä. Seulonnan jälkeen parhaiden sitojien affiniteettia tutkittiin tarkemmin suuremman mittakaavan tuotoista. EC50-määritystä (half maximum effective concentration) käytettiin Fab-kloonien affiniteetin mittaamiseen. Paras sitojaklooni RS16D01 valittiin templaatiksi geneettiseen affiniteettimaturaatioon. Menetelmäksi valittiin CDR-L3 paikkamutaatiokirjaston luominen. Kirjastossa jokainen L3-loopin aminohappo satunnaistettiin paikkakohtaisesti. Tuotetut Fab:it seulottiin kuten aikaisemman sukupolven kloonit. Lopuksi parhaita Fab-klooneja tuotettiin SpyCatcher3 fuusioina immunoglobuliinin kaltaisten molekyylin luomiseksi. L3-kirjaston Fab-kloonien sitomisominaisuuksissa ei huomattu parannusta RS16D01:een verrattuna, käytetyllä EC50-määrityksellä. Saadut EC50 arvot olivat 0,8–0,9 nM luokka kuten RS16D01-kloonin. Signaalien samankaltaisuus saattoi johtua määrityksen toteutuksesta, tai siitä, että L3-loopilla ei ole merkittävää vaikutusta affiniteettiin. SpyCatcher fuusiolla muodostetut sitojamolekyylit (IgG kaltaiset) puolestaan osoittautuivat toimivaksi menetelmäksi testin herkkyyden lisäämiseksi. Työssä tuotettuja Fab:eja testattiin sekä natiiveilla- että rekombinantti-virusproteiineilla. Kehitetyt vasta-aineet ovat potentiaalisia immunoreagensseja esimerkiksi lateraalivirtausmääritykseen, mikäli affiniteettia pystytään edelleen parantamaan testien vaatimalle tasolle.