Lamin A/C couples ER stress signaling to nuclear adaptive responses

Abstract

Mutations in the nuclear envelope protein lamin A/C (LMNA) cause a spectrum of diseases characterized by chronic cellular stress, yet how lamin A/C integrates stress signaling pathways remains incompletely understood. Here, we investigated the unfolded protein response (UPR) in p.S143P LMNA patient fibroblasts to determine how ER stress signaling is coordinated at the nuclear level. Under basal conditions, LMNA mutant patient fibroblasts exhibited increased nuclear localization of the UPR transcription factors XBP1s and ATF6 compared to control cells, suggesting persistent activation of UPR signaling. However, patient fibroblasts retained the ability to sense acute ER stress, as tunicamycin treatment strongly induced the ER chaperone BiP in both control and patient cells. Tunicamycin treatment also increased lamin A/C levels in control cells, but not in patient cells, suggesting a tenuous stress response in lamin-mutant cells. Basal lamin A/C levels were comparable between control and patient fibroblasts, indicating that the defect is stress-induced rather than constitutive. Furthermore, we demonstrated that ER stress promotes an interaction between BiP and lamin A/C in control fibroblasts, consistent with a coordinated response between the endoplasmic reticulum and the nuclear lamina. Conversely, this stress-induced BiP–lamin A/C association failed to increase in LMNA patient cells, despite normal BiP induction. These findings indicate that LMNA mutations do not abolish ER stress sensing but disrupt downstream nuclear adaptations to ER stress. Our results support a model in which lamin A/C plays an essential role in coupling ER stress signaling to nuclear remodeling and adaptive responses. Disruption of this coupling may contribute to persistent cellular stress in LMNA-associated disease.

Tumalevy on dynaaminen proteiinirakenne, joka sijaitsee tumakalvon sisäpinnan ja kromatiinin välissä. Se tarjoaa solulle mekaanista tukea, ja sillä on myös tärkeä rooli kromatiinin järjestäytymisessä, geenien ilmentymisen säätelyssä sekä DNA-vaurioiden korjausmekanismeissa. Tumalevy muodostuu lamiineista A, B ja C, jotka ovat tyypin V välikokoisia säieproteiineja. Lamiineja A ja C (A/C) koodaavan geenin (LMNA) mutaatiot aiheuttavat monia erilaisia tauteja, joihin liittyy kroonista solustressiä; näihin kuuluu esimerkiksi perinnöllinen laajentava kardiomyopatia (DCM; engl. dilated cardiomyopathy). Suomessa noin 7 % suvuittain esiintyvistä DCM-tapauksista on yhdistetty p.S143P LMNA-mutaatioon. Vaikka DCM on kliinisesti merkittävä sairaus, taudin taustalla olevia molekyylitason mekanismeja ei kuitenkaan vielä täysin ymmärretä.

Yksi merkittävä mekanismi on solulimakalvoston (ER) stressi ja laskostumattomien proteiinien indusoima stressivaste (UPR; engl. unfolded protein response). ER-stressi syntyy, kun väärin laskostuneita proteiineja kertyy solulimakalvostoon. Tämä aktivoi UPR:n kolme signalointireittiä (IRE1α, ATF6 ja PERK), joiden päätehtävänä on palauttaa solun proteiinitasapaino. Perusolosuhteissa näitä sensoreita säätelee ER-kaitsijaproteiini BiP, joka toimii keskeisenä stressisensorina ja jonka tehtävänä on avustaa muiden proteiinien laskostumista. Stressitilanteessa BiP dissosioituu ja voi myös siirtyä tumaan, missä se säätelee lamiini A/C:n järjestäytymistä. Krooninen ER-stressi ja jatkuva UPR:n aktivaatio yhdistettynä kardiovaskulaarisiin sairauksiin muodostaa noidankehän, joka johtaa vielä vakavampaan tautitilaan. Tämän tutkimuksen tavoitteena on tutkia UPR järjestelmän osien vuorovaikutuksia, lokalisaatiota ja dynamiikkaa LMNA-mutaatiota kantavissa soluissa erityisesti BiP-proteiinin osalta, jotta olisi mahdollista ymmärtää paremmin niiden roolia p.S143P-mutaation aiheuttaman DCM:n patogeneesissä.

Tutkimuksessa käytettiin kolmen terveen luovuttajan ja kolmen p.S143P LMNA-mutaatiota kantavan potilaan ihon fibroblasteja. Soluja käsiteltiin sekä perusolosuhteissa että tilanteessa, jossa soluja käsiteltiin ER-stressiä aktivoivalla tunikamysiinillä (TM). Tutkimusmenetelminä hyödynnettiin immunoblottausta (proteiinien määrän analyysi), immunofluoresenssia (proteiinien sijainnin tarkastelu), PLA:ta (Proximity ligation assay; proteiini-proteiini-vuorovaikutusten havaitseminen) sekä ko-immunopresipitaatiota (proteiiniyhteyksien analyysi).

Tutkimuksessa havaittiin, että LMNA-mutanttien potilaiden fibroblasteissa UPR oli häiriintynyt sekä perusolosuhteissa että ER-stressissä. Perusolosuhteissa UPR:n transkriptiotekijöiden ATF6 ja XBP1s määrä oli lisääntynyt potilassolujen tumassa kontrollisoluihin verrattuna, mikä viittaa jatkuvaan ER-stressiin näissä soluissa. Kun soluja käsiteltiin TM:llä, sekä potilas- että kontrollifibroblasteissa BiP:n määrä lisääntyi, mikä osoittaa ER-stressin tunnistusmekanismin toimivan kummassakin solulinjassa. Toisaalta vain kontrollisoluissa havaittiin lamiini A/C:n määrän lisääntyminen stressin seurauksena, vaikka sen määrä oli molemmissa ryhmissä samanlainen perusolosuhteissa. Tämä puutos korreloi vähentyneen LMNA-promoottorin aktiivisuuden kanssa ER-stressin aikana potilassoluissa. Lisäksi BiP:n ja lamiini A/C:n funktionaalinen vuorovaikutus oli häiriintynyt LMNA-mutanteissa potilasfibroblasteissa. Proximity ligation assay (PLA) osoitti vähäistä BiP:n ja lamiini A/C:n sitoutumista toisiinsa perusolosuhteissa potilassoluissa. Ko-immunopresipitaatio osoitti, että BiP ja lamiini A/C sitoutuivat stressitilanteessa samaan proteiinikompleksiin kontrollisoluissa, mutta eivät potilassoluissa. Immunofluoresenssitutkimus vahvisti lisäksi häiriintyneen BiP:n sijoittumisen potilasfibroblasteissa. Yhdessä nämä tulokset osoittavat UPR-aktivaatiota perusolosuhteissa, heikentynyttä stressi-indusoitua lamiini A/C:n säätelyä sekä puutteellista BiP:n ja lamiini A/C:n interaktiota potilasfibroblasteissa. Nämä kaikki löydökset kuvaavat adaptiivisen ER-stressivasteen häiriintymistä LMNA-mutaatiosta johtuen.

Tämä tutkimus paljasti, että p.S143P LMNA-mutaatio häiritsee ER-stressisignaalien ja tuman adaptaation välistä dynamiikkaa. Potilasfibroblasteilla ER-stressin havaitseminen ja UPR:n aktivaatio säilyvät, mutta keskeiset jälkivaiheen prosessit, kuten stressin indusoima lamiini A/C:n lisääntynyt ilmentyminen sekä BiP:n ja lamiini A/C:n vuorovaikutus, ovat puutteellisia. Tämä irtikytkentä viittaa siihen, että lamiini A/C toimii rakenteellisena säätelyalustana, joka on tärkeä soluliman stressisignaalien muokkaamisessa tumansisäisiksi vasteiksi. Tutkimuksen vahvuuksiin kuuluu monipuolisten menetelmien (immunofluoresenssi, immunoblottaus, co-IP, PLA) käyttö ja kyky erottaa perus- ja indusoituvat stressivasteet. Tutkimustulosten merkityksen arviointia rajoittavat fibroblastien käyttö sydänlihassolujen sijaan, rajallinen kokeiden toistomäärä sekä BiP:n ja lamiini A/C:n suoran vuorovaikutuksen jääminen toistaiseksi epäselväksi. Tulevissa tutkimuksissa tulisi tutkia ER-stressin ja UPR:n vuorovaikutuksia sydänlihassoluissa, selvittää häiriintyneen lamiini A/C:n säätelyn molekylaarinen perusta ja tarkastella, voiko BiP:n ja lamiini A/C:n kytkennän palauttaminen korjata stressivasteita, sillä se voisi tarjota uusia terapeuttisia näkökulmia LMNA-kardiomyopatioihin.