DNA-avusteinen homogeeninen immunomääritys sydänperäiselle troponiini I:lle kelaattikomplementaatiota hyödyntäen

Abstract

Homogeenisissa immunomäärityksissä signaali muodostuu immunokemiallisten sitoutumisreaktioiden seurauksena, jolloin sitoutuneiden ja sitoutumattomien leimamolekyylien erottelu on tarpeetonta, ja määritykset ovat näin ollen yksinkertaisia ja nopeita. Epäspesifinen taustasignaali heikentää kuitenkin homogeenisten määritysten suorituskykyä heterogeenisiin määrityksiin verrattuna. DNA:n hyödyntäminen immunomäärityksissä mahdollistaa leimamolekyylien tarkemman hallinnan sekä nukleiinihappodiagnostiikassa käytettyjen tehokkaiden havainnointimenetelmien hyödyntämisen proteiinidiagnostiikassa, minkä seurauksena nykyään on mahdollista havaita merkittävästi aiempaa pienempiä proteiinipitoisuuksia nopeasti ja tehokkaasti.

Tutkielman kokeellisessa osassa kehitettiin DNA-avusteinen kelaattikomplementaatioon perustuva homogeeninen immunomääritys sydänperäiselle troponiini I:lle. Kelaattikomplementaatio on leimateknologia, jossa lantanidikelaatti on jaettu kahdeksi luminoimattomaksi osaksi, ioninkantajakelaatiksi ja valoa absorboivaksi ligandiksi, jotka muodostavat luminoivan lantanidikelaatin ainoastaan yhdistyessään spesifisten sitoutumisreaktioiden seurauksena. Määritystä varten ioninkantajakelaatti ja ligandi liitettiin oligonukleotidien välityksellä paikkaspesifisesti kahteen analyytille spesifiseen vasta-ainefragmenttiin. Vasta-ainefragmenttien sitoutuessa analyyttiin samanaikaisesti, oligonukleotidien paikallinen pitoisuus kasvaa, jolloin niissä oleva komplementaarinen signaalisekvenssi pariutuu yhdistäen ioninkantajakelaatin ja ligandin luminoivaksi lantanidikelaatiksi.

Tutkimuksessa kelaattikomplementaatiota hyödynnettiin ensimmäistä kertaa yhdessä vasta-ainesitojien kanssa ja osoitettiin, että menetelmää hyödyntäen voidaan minimoida homogeenisten immunomääritysten herkkyyttä häiritsevä epäspesifinen taustasignaali, mikä mahdollistaa nopeiden ja herkkien proteiinimääritysten kehittämisen. Määrityksen laskennallinen havaintoraja (0,37 ng/ml) oli vertailukelpoinen samoihin sitojiin perustuvan heterogeenisen referenssimäärityksen havaintorajan (0,26 ng/ml) kanssa, ja sitä olisi todennäköisesti edelleen mahdollista parantaa optimoimalla muun muassa ioninkantajakelaatin ja ligandin yhdistävää signaalisekvenssiä. Määritys soveltuisi nopeutensa ansiosta erinomaisesti vieritestaukseen, sillä tulos oli mitattavissa jo 6 minuutin inkuboinnin jälkeen.