Embigiinin tehtävien kartoitus siRNA-hiljennyksen avulla : munuaisten sekä putkimaisten rakenteiden kehitys

Abstract

Embigiini (GP70) on transmembraaninen glykoproteiini. Embigiiniä on löydetty kiveksistä, lisäkiveksistä, munuaisista, ihosta sekä keuhkoista. Hiirillä embigiiniä ilmentyy alkionkehityksen aikana paljon ja iän myötä sen ilmentyminen vähenee, joten se on oletettavasti alkionkehityksessä tärkeä proteiini. On myös huomattu, että se edistää solusta soluväliaineeseen tapahtuvaa vuorovaikutusta. Tiedetään, että se toimii avustavana proteiinina monokarboksylaattitransportteri-2:lle (MCT2) ja uusia biologisia prosesseja, joihin embigiini vaikuttaa, selvitetään tässä tutkimuksessa. Tutkimuksen tarkoituksena on selvittää, miten embigiinin hiljennys vaikuttaa solun geeniekspressioprofiiliin sekä tutkia proliferaatiokokeilla hiljennyksen vaikutusta solujen kykyyn jakautua erilaisilla pinnoilla.

Tässä työssä embigiiniä hiljennettiin kahdella eri siRNA:lla hiiren IMBCA keratinosyyteistä. Hiljennyksien annettiin vaikuttaa 48 h jonka jälkeen solujen RNA eristettiin. Hiljennyksien onnistuminen tarkistettiin western blotilla. RNA-näytteet sekvensoitiin uuden sukupolven sekvensointimenetelmällä. Sekvensointidata analysoitiin kolmella eri geeninrikastusohjelmalla. Hiljennettyjen solujen jakautumista seurattiin myös eri pinnoilla. Kuoppalevyt päällystettiin poly-l-lysiinillä, fibronektiinillä tai annettiin kasvaa käsittelemättömällä muovipinnalla. Solujen määrä mitattiin 450 nm absorbanssissa hiljennnyksen jälkeen 48 h, 72 h ja 96 h aikapisteissä. Mittaus perustuu elävien solujen määrään kuopissa.

Geeninrikastusanalyyseistä huomattiin munuaisten kehityksen sekä urogenitaalijärjestelmän kehityksen geenien rikastuneen hiljennyksen vuoksi. Myös muita huomionarvoisia rikastuneita biologisia prosesseja olivat esimerkiksi putkimaisten rakenteiden kehitys, verisuonirakenteiden kehitys, migraatio ja solun lokalisaatio. Proliferaatiokokeessa havaittiin hiljennyksen vaikutuksen lakkaavan 72 h hiljennyksen jälkeen. Hiljennettyjen solujen jakautuminen ja kasvu fibronektiinipinnalla oli hitaampaa kuin kontrollisolujen, mikä tukee havaintoa siitä, että embigiini edistää solunjakautumista.