Glukosinolaattien tunnistaminen ja kvantitointi uusien ryhmäkohtaisten UPLC-MS/MS-menetelmien avulla

Abstract

Glukosinolaatit ovat kasvien tuottamia erikoistuneita metaboliitteja, joita on pääasiassa ristikukkais- eli Brassicaceae-heimon kasveissa, kuten kaaleissa, rypseissä ja sinapeissa. Glukosinolaattien rakenne koostuu sokeriosasta, tiohydroksimaatti-O-sulfonaattiryhmästä sekä alifaattisesta, aromaattisesta tai indolisivuryhmästä, jotka usein määrittävät niiden biologisen aktiivisuuden. Glukosinolaattien sivuryhmiä on karakterisoitu yli 130. Glukosinolaatit muuntuvat niiden aktiiviseen muotoon kasvisolukon kudosrakenteen hajotessa, jolloin myrosinaasi-entsyymit hydrolysoivat ne isotiosyanaateiksi, nitriileiksi, oksatsolidiini-2-tioleiksi tai indoli-3-karbinoleiksi riippuen vallitsevista olosuhteista ja sivuryhmän rakenteesta. Vaikka glukosinolaatit ovat yleisiä kasvien metaboliitteja, niiden tunnistamiseen ja kvantitointiin käytettyjä kehittyneitä MRM- tai PRM-menetelmiä on kehitetty vähän. Tässä työssä kehitettiin herkät ja selektiiviset UPLC-MS/MS-menetelmät glukosinolaateille kahdelle eri massaspektrometrille. Menetelmät kehitettiin ryhmä- sekä yhdistekohtaisesti 23 glukosinolaatille. Kullekin glukosinolaatille määritettiin havaitsemisraja (LOD) ja määritysraja (LOQ) sekä tarkasteltiin matriisiuutteen vaikutusta menetelmien herkkyyteen ja selektiivisyyteen. Lisäksi tarkasteltiin korkean resoluution massaspektrometrilla ja kolmoiskvadrupolilla luotujen menetelmien eroavaisuuksia. Viiden glukosinolaateille ryhmäkohtaisen hajoamistuotteen avulla valmistettiin herkkä ja selektiivinen MRM-menetelmä, jossa alhaisin havaitsemisraja oli 52,18 ng/ml ja alhaisin määritysraja 0,16 µg/ml. Ryhmäkohtaisen MRM-menetelmän lineaaristen alueiden ylärajat vaihtelivat 8,33–100 µg/ml. Yhdistekohtaisella MRM-menetelmällä saavutettiin alhaisemmat havaitsemis- ja määritysrajat kuin ryhmäkohtaisella MRM-menetelmällä, mutta lineaaristen alueiden ylärajat olivat matalampia. Korkean resoluution massaspektrometrin PRM-menetelmä mahdollisti yhdisteen tarkemman karakterisoinnin, tosin analysointitulosten tulkitseminen vaatii enemmän aikaa ja osaamista kolmoiskvadrupolin MRM-menetelmään verrattuna. PRM-menetelmän tuloksena saadaan alkuperäisen ionin fragmentaatiospektri, josta pitää manuaalisesti tarkastaa glukosinolaattien tuoteionit. PRM-menetelmän havaitsemis- ja määritysrajat olivat selvästi korkeampia kuin MRM-menetelmän. Alhaisin havaitsemisraja PRM-menetelmällä saavutettiin alkuperäisellä ionilla m/z 259 pitoisuudessa 0,57 µg/ml.