Korkean suorituskyvyn menetelmän luonti luonnonyhdisteiden antibioottiaktiivisuuden selvittämiseksi

Abstract

Antimikrobiresistenssi on maailmanlaajuinen ongelma ja vaikka antimikrobilääkkeiden teho Suomessa on edelleen hyvä, on maailmanlaajuisesti tilanne pahenemassa. Kamppaillaksemme tätä vastaan on tärkeää tutkia ja löytää uusia yhdisteitä, jotka voisivat joko toimia itse antibiootteina tai voisivat toimia apureina nykyisten antibioottien tehokkuuden lisäämiseksi. Kasvikunta sisältää tuhansia potentiaalisia yhdisteitä, joiden antimikrobikapasiteettia ei vielä tunneta. On siis tärkeää, että luodaan korkean suorituskyvyn menetelmiä tämän tutkimiseksi, jotta datan keruu toimisi nopeasti ja tehokkaasti. Kasvikunnasta löytyvät yhdisteet soveltuvat erinomaisesti tällaisen menetelmän luomiseen, käyttöön ja kehittämiseen. Luodaksemme menetelmän, valitsimme antimikrobiresistenssin suhteen keskeisiä bakteereja sekä biologiselta aktiivisuudeltaan tunnettuja malliyhdisteitä, joiden avulla oli mahdollista optimoida menetelmäolosuhteita. Antibioottiherkkyyttä testataan pääosin kahdella tavalla, agardiffuusio kiekkomenetelmällä sekä kasvatusliuoksen laimennusmenetelmällä. Agardiffuusiossa inhibiittori diffundoituu kasvatusmaljalla sille ympättyyn bakteeriliuokseen osoittaen inhibition kasvunestovyöhykkeenä. Kasvatusliuoksen laimennusmenetelmällä inhibiittori lisätään suoraan bakteeriliuokseen ja tästä laimennoksesta voidaan selvittää minimi-inhibitioon vaadittava inhibiittorikonsentraatio. Työn tarkoituksena oli tutkia kasviyhdisteiden antibioottipotentiaaleja ja luoda tätä varten menetelmiä. Aluksi luotiin agardiffuusiomenetelmää muokkaamalla kiekkomenetelmästä kuoppamenetelmä, joka toimi referenssimenetelmänä. Se kertoi luotettavasti ja toistettavasti, inhiboiko yhdiste bakteeria vai ei. Etu kiekkodiffuusioon oli inhibiittorin suurempi applikointivolyymi kuopan sisään kuin suodatinpaperille. Tämän jälkeen kehitettiin kuoppalevylle soveltuva korkean suorituskyvyn menetelmä, jolla on mahdollista etsiä bakteereita inhiboivaa aktiivisuutta ja määrittää minimi-inhibitiokonsentraatiota eli yhdisteen tehoa. Kuoppalevymenetelmällä pystytään yhdellä analyysillä tarkistamaan 90 kombinaatiota. Kehitetty menetelmä mahdollistaa kemiallisesti osittain tuntemattomien (suomalaiset kasvilajit) ja kemiallisesti täysin tuntemattomien lajien (trooppiset lajit) antibakteeriominaisuuksien laajan testauksen ja vertailun. Menetelmää hyödyntäen onnistuttiin toteamaan monien erilaisten kasvinäytteiden osoittavan inhibitiopotentiaalia 24 h seurannassa. Onnistuttiin myös toteamaan, että jotkin yhdisteet olivat täysin tehottomia tiettyjä bakteereita vastaan mutta tehosivat erinomaisesti toisiin. Tämän vuoksi yhdisteiden ja kasvinäytteiden antimikrobivaikutuksia on tärkeä tutkia useiden mallibakteerien avulla.