TLR4 ja TLR5 HPV-positiivisissa ja HPV-negatiivisissa pään ja kaulan alueen syöpäsoluissa

Abstract

Background Toll like receptors function as pattern recognition receptors in innate immunity and activate innate and adaptive immune systems. Differential expression of these receptors is reported in malignant and benign tissues and they may contribute to the development of the inflammatory tumor microenvironment with yet unknown mechanisms. Our aim in this study was to see presence of toll like receptor (TLR) 4 and 5 and their behavior after LPS stimulation in HPV-positive and HPV-negative oropharyngeal carcinoma cell lines. Methods We cultured 4 different oropharyngeal cell lines which HVP status was known. We used western blot to detect the possible changes in TLR 4 and TLR 5 expression levels. We additionally studied extracted protein from tissue samples to explore cellular location dependent differences in the molecular weight of these TLRs LPS was used to explore the possible HPV-dependent differences in cellular responses to microbial stimulus. Results According to WB analysis, all cell-lines expressed TLR4 and TLR5 protein. The expressions were strongest in UD-SCC-2 (HPV positive) and UT-SCC-65 (HPV negative) cell lines. LPS did not effect TLR5 expression. Conclusion TLR4 and TLR5 are both expressed in both HPV positive and HPV negative cell lines. The TLR expression is not dependent on HPV but possibly on the malignancy level.

Johdanto Toll-like reseptorit (TLR:t) ovat perhe proteiineja, jotka ovat osa immuunipuolustusta. Ne aktivoituvat taudinaiheuttajien ja elimistön omien vaurioituneiden solujen tuottamista molekyyleistä, ja aktivoituessaan ne käynnistävät puolustusvasteen muun muassa säätelemällä sytokiinituotantoa, geenien ilmenemistä sekä solujen erilaistumista, jakautumista ja apoptoosia. TLR:t ilmenevät tavallisesti puolustussoluissa ja epiteelisoluissa, mutta niitä on löydetty myös syöpäkasvaimista ja niiden merkitystä syövässä on tutkittu. Näillä reseptoreilla vaikuttaisi olevan syöpää ehkäiseviä ja syövälle altistavia ominaisuuksia. Ne johtuvat reseptorista, sen sijainnista solussa, syövästä sekä immunipuolustuksen toiminnasta.

Tutkimuksemme tavoitteena oli tarkastella kahden TLR:n, TLR4:n ja TLR5:n, ilmenemistä neljä pään- ja kaulan alueen syövän soluissa sekä verrokkina terveissä ihon soluissa. Pään ja kaulan alueen syövissä on usein mukana papilloomavirusinfektio, joka vaikuttaa syövän hoitoon ja ennusteeseen. Tarkastelimme, käyttäytyvätkö HPV-positiiviset ja HPV-negatiiviset syövät samalla tavalla solutasolla. Ihmisen papilloomavirukset (human papilloma virus, HPV) ovat pieniä kaksijuosteisia DNA-viruksia. HPV-infektio saa elimistössä aikaan tulehdusreaktion, mutta virus voi karttaa immuunivasteen esimerkiksi vaikuttamalla sytokiinien eritykseen.

Aineisto ja menetelmät Tutkimuksessa oli mukana viisi solulinjaa, joihin kuului neljä suun ja kaulan alueen levyepiteelikarsinoomasolulinjaa sekä terve ihon solulinja. Osa jokaisen solulinjan soluista altistettiin lipopolysakkaridille (LPS), joka on TLR4-reseptoria aktivoiva molekyyli. Proteiinien ilmentymistä soluissa tutkittiin Western Blotin avulla.

Tulokset TLR4 Western Blot -tulosten mukaan TLR4-ekspressio oli vahvin SCC-2(HPV+) ja SCC-65 (HPV–) -solulinjoissa. TLR4-ekspressio oli matala terveissä soluissa. Havaitsemamme molekyyli oli kooltaan noin 100 kDa. LPS ei selkeästi aktivoinut reseptorin ekspressiota, paitsi hieman HaCaT-soluilla 8h altistuksen jälkeen. TLR5 100kDa:n painoisen proteiinin lisäksi myös pienempiä molekyylejä värjäytyi kokeissa. Tämän takia teimme tutkimukset myös toisella TLR5-vasta-aineella, mutta värjäytyminen oli samanlaista. Havaitsimme enemmän 100kDa:n värjäytymistä maligneissa solulinjoissa kuin benignissä solulinjassa, jossa vahvin värjäytyminen oli noin 50kDa. LPS:llä ei ollut vaikutusta reseptorin ekspressioon. Ei havaittu yhteyttä HPV:n ja TLR5-ekspression välillä. Arvelimme pienten molekyylipainojen värjäytymisen johtuvan TLR5:n eri ilmenemispaikoista (sytoplasma, solukalvo). Tutkimme TLR5-ekspressiota tonsillasyöpäkudoksista eristetyistä proteii-neista, joiden TLR5:n ilmenemispaikka oli tiedossa. Emme havainneet solusijainnin ja Western Blot -värjäyksen välillä korrelaatiota.

Johtopäätökset TLR4 ja TLR5 ilmenevät maligneissa solulinjoissa. LPS:lla ei ollut merkittävää vaikutusta TLR5-ekspressioon. TLR4:n ja TLR5:n ilmeneminen vaikutti kasvavan pahalaatuisuuden lisääntyessä.