Swedish strong snus and the effects on oral mucosa : in vitro study with monolayer and 3D-cell culture model

Abstract

The daily use of snus is common in Scandinavia and it has become more common since 2000s. During 2005-2020 high-nicotine snus types have surpassed the lower nicotine content types. Highest snus usage rate, 20%, were among 20-34 year-olds in Finland during 2023.

Smokeless tobacco products are world widely known as a risk factor for oral cancer, but association between oral cancer and Swedish snus still remains unclear. Swedish moist snus is known to have impact on oral health, such as tooth erosion, gingival recessions and pH-level changes in saliva.

The aim of this study was to investigate the effects of high-nicotine Swedish snus on oral mucosa in vitro. Our study focused on cytotoxicity, impact on wound healing and mucosal homeostasis and differentiation in vitro.

A monolayer and a three-dimensional cell culture methods were used in this study to demonstrate oral mucosa. Models were constructed using keratinocyte cell line and fibroblasts isolated from healthy human oral biopsy samples. Models were predisposed to snus extract prepared by mixing Swedish snus and tissue culture medium. Snus extracts were prepared from three commercial Swedish snus brands with nicotine contents of 8.5 mg/g, 22 mg/g and 26 mg/g.

Wound healing and cell viability was investigated using monolayer cell cultures. Histology and immunohistological profile of three-dimensional cell cultures exposed to Swedish snus were analyzed. Cell adhesion, cell proliferation and immune response markers were studied.

Based on the results, the effects of Swedish high-nicotine snus products on oral mucosa differs significantly from other known smokeless tobacco products. Strong snus extracts impaired cell migration and cell viability in vitro. Notably, even though the strongest snus product had highest decrease in cell viability, cell migration was less inhibited compared to the lower nicotine containing products. Based on the results with 3D-cell models, histological and immunohistochemical features had similar trend compared to findings of monolayer cell cultures. Results suggest that the effects on oral cells cannot be solely explained by nicotine content among snus products.

This study is one of the first studies to investigate the oral mucosa effects of high-nicotine Swedish snus. The results of this study shouldbe confirmed in future studies. However, the findings indicate some concerns about the effects of high-nicotine snus on oral mucosa.

Ruotsalaisen nuuskan käyttö on yleistä Pohjoismaissa ja sen käyttö on yleistynyt Suomessa 2000-luvulla. Vuosien 2005-2020 välillä korkean nikotiinipitoisuuden nuuskan käyttö on lisääntynyt. Yleisintä nuuskan käyttäminen (päivittäin tai satunnaisesti) Suomessa oli vuonna 2023 20-34-vuotiaiden keskuudessa. Nuuskaa heistä käytti 20% ikäisistään.

Maailmanlaajuisesti nuuskan tiedetään olevan suusyövän riskitekijä. Ruotsalaisella nuuskalla tiedetään olevan monia vaikutuksia suussa, kuten hampaiden kulumista, ienvetäymiä sekä muutoksia syljen pH:ssa. Ruotsalaisen nuuskan yhteys suusyöpään on tutkimusten perusteella kuitenkin yhä epäselvä. Perinteisten nuuskatyyppien rinnalle on tullut 2010 -luvulla vahvempia nuuskatyyppejä, joiden vaikutuksia ei tunneta.

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia ruotsalaisen vahvan nuuskan vaikutusta suun limakalvoon in vitro -solumallien avulla. Tutkimme nuuskan sytotoksisuutta, vaikutusta haavan paranemiseen sekä nuuskan vaikutusta limakalvon epiteelin homeostaasiin ja kykyyn erilaistua.

Tutkimusmenetelminä käytettiin kaksiulotteista monolayer- sekä kolmiuloitteista raft-kudosviljelymallia, joiden avulla mallinnettiin suun limakalvoa kontroilloiduissa laboratorio-olosuhteissa. Malleissa käytettiin ihmisen suun limakalvolta eristettyä fibroblasti- ja keratinosyytti-solukantaa. Mallit altistettiin elastusaineelle, johon oli lisätty nuuskauute. Nuuska-altisteina käytettiin kolmea tunnettua ruotsalaista nuuskamerkkiä, joiden nikotiinipitoisuudet olivat 8.5 mg/g, 22 mg/g ja 26 mg/g.

Monolayer-viljelmissä tutkittiin haavan paranemista sekä solujen elinkelpoisuutta. Kudosviljelmien histologinen kuva ja immunohistologiset piirteet tutkittiin. Tutkimuksissa keskityttiin solujen tartuntaan, jakautumiseen sekä immuunivasteeseen.

Tulosten perusteella ruotsalaisten korkean nikotiinipitoisuuden nuuskatyyppien vaikutus suun soluihin eroaa merkittävästi perinteisten tunnettujen nuuskatyyppien vaikutuksista. Vahvat nuuskauutteet heikensivät solujen migraatiota ja madalsivat elinkelpoisuutta in vitro. Vaikka korkeimman tutkitun nuuskatyypin aiheuttama lasku solujen elinkelpoisuuteen oli suurin, solujen migraatio estyi vähemmän kuin matalamman nikotiinipitoisuuden verrokeilla. 3D-solumallien histologiset ja immunohistokemialliset löydökset olivat samankaltaisia kuin monolayer-mallien tulokset. Saattaakin olla niin, että vaikutukset suun soluihin eivät selity pelkästään nuuskatyyppien välisillä nikotiinipitoisuuden eroilla.

Tämä tutkimus on ensimmäisiä tutkimuksia ruotsalaisen vahvan nuuskan vaikutuksista suun limakalvon soluihin in vitro. Tulokset tulee kuitenkin varmistaa lisätutkimuksissa ja niitä tulisi jatkossa verrata nuuskan aiheuttamiin limakalvomuutoksiin in vivo.