Assay development and study of a mutation affecting gonadotropin action
Trehan, Ashutosh (2016-09-23)
Assay development and study of a mutation affecting gonadotropin action
Trehan, Ashutosh
(23.09.2016)
Annales Universitatis Turkuensis D 1246 Turun yliopisto
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:ISBN:978-951-29-6586-1
https://urn.fi/URN:ISBN:978-951-29-6586-1
Kuvaus
Siirretty Doriasta
Tiivistelmä
Menetelmäkehitys ja gonadotropiinien toimintaan vaikuttava mutaatio
Gonadotropiinivaikutus, jota välittää kolme hormonia, luteinisoiva hormoni (LH), follikkelia stimuloiva hormoni (FSH) ja istukkagonadotropiini (hCG), on keskeisen tärkeää sukupuolten erilaistumiselle, murrosiän aikaiselle kehitykselle sekä aikuisen lisääntymistoiminnoille. Gonadotropiinit sitoutuvat kohdesolujensa spesifisiin reseptoreihin, joita ovat luteinisoivan hormonin/istukkagonadotropiinin reseptori (LHCGR) ja follikkelia stimuloivan hormonin reseptori (FSHR); molemmat kuuluvat G-proteiineja sitovien reseptorien (GPCR) geeniperheeseen. Hormonin reseptoriin sitoutumisen aiheuttama stimulaatio saa aikaan syklisen adenosiini-3’,5’-monofosfaatin (cAMP) muodostumiseen GαS-proteiinin välityksellä ja adenylaattisyklaasientsyymin katalysoimana. Potilaista löydettyjen ja mutageneesillä tuotettujen mutaatioiden mallintaminen käyttäen kohdennettua mutageneesiä on ollut oleellisen tärkeää oppiessamme ymmärtämään molekyylien rakenne-funktio-yhteyksiä gonadotropiinivaikutuksen yhteydessä. Tässä väitöskirjatyössä esitellään uusi potilaan LH:n beta-alayksikön inaktivoiva mutaatio sekä kuvataan kaksi uutta menetelmää sen molekyylitason karakterisoimiseksi. Ensimmäinen menetelmä, REPLACR-mutageneesi (Recombineering of Ends of linearised PLAsmids after PCR), on yksivaiheinen kohdennetun mutageneesin menetelmä, jossa käytetään rekombinaatio (recombineering) -menetelmää pistemutaatioiden (poistot, lisäykset, korvaukset) aikaansaamiseksi plasmidivektorissa. REPLACR-mutageneesi on huokea vaihtoehto kaupallisille reagenssisarjoille, ja niihin verrattuna siinä on vähemmän välivaiheita tehokkuuden pysyessä samanlaisena. Toinen menetelmä, nimeltään CANDLES (Cyclic AMP iNdirect Detection by Light Emission from Sensor cells), kehitettiin mittaamaan soluviljelyjen kineettistä cAMP-vastetta ilman tarvetta transfektoida soluja reaaliaikaisella cAMP-sensorilla, mikä on erityisen vaikeaa primaarisoluilla. Lopuksi karakterisoimme hypogonadiselta potilaalta löydetyn lysiini-20:n (Lys20) deleetiosta johtuvan LH:n beta-ketjun inaktivoivan mutaation aiheuttamat molekyylitason muutokset hormonin toiminnassa.
Gonadotropiinivaikutus, jota välittää kolme hormonia, luteinisoiva hormoni (LH), follikkelia stimuloiva hormoni (FSH) ja istukkagonadotropiini (hCG), on keskeisen tärkeää sukupuolten erilaistumiselle, murrosiän aikaiselle kehitykselle sekä aikuisen lisääntymistoiminnoille. Gonadotropiinit sitoutuvat kohdesolujensa spesifisiin reseptoreihin, joita ovat luteinisoivan hormonin/istukkagonadotropiinin reseptori (LHCGR) ja follikkelia stimuloivan hormonin reseptori (FSHR); molemmat kuuluvat G-proteiineja sitovien reseptorien (GPCR) geeniperheeseen. Hormonin reseptoriin sitoutumisen aiheuttama stimulaatio saa aikaan syklisen adenosiini-3’,5’-monofosfaatin (cAMP) muodostumiseen GαS-proteiinin välityksellä ja adenylaattisyklaasientsyymin katalysoimana. Potilaista löydettyjen ja mutageneesillä tuotettujen mutaatioiden mallintaminen käyttäen kohdennettua mutageneesiä on ollut oleellisen tärkeää oppiessamme ymmärtämään molekyylien rakenne-funktio-yhteyksiä gonadotropiinivaikutuksen yhteydessä. Tässä väitöskirjatyössä esitellään uusi potilaan LH:n beta-alayksikön inaktivoiva mutaatio sekä kuvataan kaksi uutta menetelmää sen molekyylitason karakterisoimiseksi. Ensimmäinen menetelmä, REPLACR-mutageneesi (Recombineering of Ends of linearised PLAsmids after PCR), on yksivaiheinen kohdennetun mutageneesin menetelmä, jossa käytetään rekombinaatio (recombineering) -menetelmää pistemutaatioiden (poistot, lisäykset, korvaukset) aikaansaamiseksi plasmidivektorissa. REPLACR-mutageneesi on huokea vaihtoehto kaupallisille reagenssisarjoille, ja niihin verrattuna siinä on vähemmän välivaiheita tehokkuuden pysyessä samanlaisena. Toinen menetelmä, nimeltään CANDLES (Cyclic AMP iNdirect Detection by Light Emission from Sensor cells), kehitettiin mittaamaan soluviljelyjen kineettistä cAMP-vastetta ilman tarvetta transfektoida soluja reaaliaikaisella cAMP-sensorilla, mikä on erityisen vaikeaa primaarisoluilla. Lopuksi karakterisoimme hypogonadiselta potilaalta löydetyn lysiini-20:n (Lys20) deleetiosta johtuvan LH:n beta-ketjun inaktivoivan mutaation aiheuttamat molekyylitason muutokset hormonin toiminnassa.
Kokoelmat
- Väitöskirjat [2864]