Regulation of Schwann cells and osteoclasts with an emphasis on NF1-deficient cells

Abstract

ABSTRACT

Neurofibromatosis type 1 (NF1) is a dominantly inherited cancer predisposition syndrome, which affects one in 2000 individuals worldwide. NF1 exhibits a variety of clinical symptoms. Neurofibromas, the hallmarks of NF1, carry two different genotypes of Schwann cells: cells with a germline mutation and a healthy NF1 allele (NF1+/- ) and those with an inactivation of both alleles (NF1-/- ). These tumors typically start to appear during puberty, and their number and size grow during pregnancy indicating hormone responsiveness. The present study showed that cultured NF1-/- Schwann cells were more sensitive to the effects of estradiol, testosterone, and human chorionic gonadotropin (hCG) than NF1+/- cells.

Multinucleated osteoclasts are responsible for bone resorption and actin ring formation is essential to bone resorption. The dynamic actin structure undergoes rapid changes and plays several roles including cellular movement and maintenance of the cell shape. The osteoclast actin structure consists of a podosome belt with a loose actin “cloud” on its top. STED and confocal microscopy revealed a new insight into osteoclast actin structure. This was a curved and branched actin structure extended from the substratum level to the top of the cell co-localizing with membrane lipids. In addition, thick actin containing micrometer-level tubes were bridging adjacent osteoclasts above the level of the substratum.

The roles of the Ras/PI3K/Akt/mTOR, Ras/Raf/MEK1/2/ERK1/2, calcium-PKC, and p38 signaling pathways in human osteoclast differentiation and bone resorption were evaluated. Down-regulation of most of these pathways by chemical inhibitors decreased the number of osteoclasts from NF1 patients and controls. However, inhibition of p38 increased osteoclastogenesis but not the function of the cells. In addition, inhibition of Ras increased the number of control osteoclasts but decreased the number of NF1 cells. We found that the number of osteoclasts appeared to correlate with the phosphorylation of ERK1/2, which may act as a key driver of human osteoclast differentiation.

The aim of this in vitro study was to further develop, characterize, and test culture conditions for cell types involved in the pathogenesis of two distinct hallmark lesions of NF1. Specifically, these lesions include the neurofibroma tumors largely composed of Schwann cells; and the skeletal lesions such as osteoporosis and false joints, where osteoclasts apparently play a major role.

Keywords: Neurofibromatosis 1, Schwann cell, osteoclast, actin, signaling pathway

TIIVISTELMÄ

Neurofibromatoosi tyyppi 1 (NF1) on vallitsevasti periytyvä syöpätyypeille altistava oireyhtymä, jonka esiintyvyys on maailmanlaajuisesti 1/2000. NF1 sairauteen liittyy useita erilaisia kliinisiä löydöksiä. Neurofibroomat ovat NF1 sairauden keskeisimpiä tunnusmerkkejä, jotka sisältävät kahden eri genotyypin Schwannin soluja: osassa soluista on heterotsygoottinen NF1+/- genotyyppi, jossa toinen alleeli on toimiva, kun taas osalle soluista on tapahtunut toisenkin alleelin katoaminen NF1-/- . Neurofibroomilla on taipumus ilmestyä murrosiän aikana ja niiden koko sekä määrä kasvavat raskauden aikana. Kasvainten ajatellaan reagoivan hormoneihin. Tässä tutkimuksessa osoitettiin, että erityisesti NF1-/- genotyypin Schwannin solut ovat erityisen herkkiä estradiolille, testosteronille ja koriongonadotropiinille.

Monitumaisten osteoklastien tehtävä on hajottaa luuta. Aktiinirenkaan muodostuminen on välttämätöntä luun hajotukselle. Aktiinin dynaaminen rakenne muuttuu nopeasti ja aktiinilla on useita rooleja solujen liikkumisesta solun tukirangan muodostumiseen. Osteoklastien aktiinirakenne muodostuu niin kutsutusta podosomivyöstä ja sen päällä olevasta löyhästä aktiini pilvestä. Väitöskirjassa tutkittiin STED- ja konfokaalimikroskopian avulla osteoklastien aktiinirakennetta. Tutkimuksessa havaittiin, että taipuisa ja haarautuva aktiinirakenne ulottui osteoklastin kasvualustalta solun yläosaan asti. Tutkimuksessa löydettiin mikrometrin kokoisia tunneleita kahden eri osteoklastin välillä, jotka kulkeutuivat yhdestä solusta toiseen.

Väitöskirjassa tutkittiin Ras/PI3K/Akt/mTOR, Ras/Raf/MEK1/2/ERK1/2, kalsiumPKC, and p38 signalointiteiden roolia osteoklastien erilaistumisessa. Useimpien signalointiteiden todettiin vähentävän osteoklastien erilaistumista sekä kontrolli että NF1-potilaiden soluilla. Tutkimuksessa havaittiin, että p38 signaloinnin estäminen lisäsi osteoklastien erilaistumista molemmilla tutkituilla solutyypeillä. Lisäksi havaittiin, että Ras-signaloinnin estäminen lisäsi kontrolli solujen määrää, kun taas NF1 potilaiden osteoklastien määrä väheni. Väitöskirjatutkimuksessa todettiin osteoklastien määrän korreloivan ERK1/2 fosforylaation kanssa, joka saattaa olla osteoklastien erilaistumisen avaintekijä. Tämän in vitro tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia soluja, jotka ovat osallisina NF1-sairauden patogeneesissä ja erityisesti sairauden keskeisimmissä tunnusmerkeissä. Näihin kuuluvat ihon neurofibroomat, jotka koostuvat suurelta osin Schwannin soluista sekä luuston leesiot, kuten osteoporoosi tai valenivelen muodostuminen, joissa osteoklasteilla on ilmeisesti merkittävä rooli.

Avainsanat: Neurofibromatoosi 1, Schwannin solu, osteoklasti, aktiini, signalointitie