Anti-nukleoproteiinivasta-aineen affiniteetin parantaminen geenitekniikan keinoin ja koronavirusmäärityksen kehittäminen kuoppalevyformaatissa
Saarinen, Roope (2022-04-06)
Anti-nukleoproteiinivasta-aineen affiniteetin parantaminen geenitekniikan keinoin ja koronavirusmäärityksen kehittäminen kuoppalevyformaatissa
(06.04.2022)
Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.
suljettu
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2022050533069
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2022050533069
Tiivistelmä
Covid-19 diagnosoimiseksi on kehitetty antigeenitestejä. Ne ovat PCRmenetelmää nopeampia ja halvempia, mutta kärsivät usein alhaisesta herkkyydestä. Työssä tuotettiin ja paranneltiin vasta-aineita, jotta saavutettaisiin nopea, luotettava ja yksinkertainen testi.
Faaginäyttötekniikalla rikastettiin vasta-ainekirjasto, joka kloonattiin pAK400 tuottovektoriin. Tuotot tehtiin 96 kuoppalevylle yksittäisinä klooneina. Tuotettujen Fab-kloonien sitomiskykyä tarkasteltiin ei-kilpailevalla immunomäärityksellä. Seulonnan jälkeen parhaiden sitojien affiniteettia tutkittiin tarkemmin suuremman mittakaavan tuotoista. EC50-määritystä (half maximum effective concentration) käytettiin Fab-kloonien affiniteetin mittaamiseen.
Paras sitojaklooni RS16D01 valittiin templaatiksi geneettiseen affiniteettimaturaatioon. Menetelmäksi valittiin CDR-L3 paikkamutaatiokirjaston luominen. Kirjastossa jokainen L3-loopin aminohappo satunnaistettiin paikkakohtaisesti. Tuotetut Fab:it seulottiin kuten aikaisemman sukupolven kloonit. Lopuksi parhaita Fab-klooneja tuotettiin SpyCatcher3 fuusioina immunoglobuliinin kaltaisten molekyylin luomiseksi.
L3-kirjaston Fab-kloonien sitomisominaisuuksissa ei huomattu parannusta RS16D01:een verrattuna, käytetyllä EC50-määrityksellä. Saadut EC50 arvot olivat 0,8–0,9 nM luokka kuten RS16D01-kloonin. Signaalien samankaltaisuus saattoi johtua määrityksen toteutuksesta, tai siitä, että L3-loopilla ei ole merkittävää vaikutusta affiniteettiin. SpyCatcher fuusiolla muodostetut sitojamolekyylit (IgG kaltaiset) puolestaan osoittautuivat toimivaksi menetelmäksi testin herkkyyden lisäämiseksi. Työssä tuotettuja Fab:eja testattiin sekä natiiveilla- että rekombinantti-virusproteiineilla.
Kehitetyt vasta-aineet ovat potentiaalisia immunoreagensseja esimerkiksi lateraalivirtausmääritykseen, mikäli affiniteettia pystytään edelleen parantamaan testien vaatimalle tasolle.
Faaginäyttötekniikalla rikastettiin vasta-ainekirjasto, joka kloonattiin pAK400 tuottovektoriin. Tuotot tehtiin 96 kuoppalevylle yksittäisinä klooneina. Tuotettujen Fab-kloonien sitomiskykyä tarkasteltiin ei-kilpailevalla immunomäärityksellä. Seulonnan jälkeen parhaiden sitojien affiniteettia tutkittiin tarkemmin suuremman mittakaavan tuotoista. EC50-määritystä (half maximum effective concentration) käytettiin Fab-kloonien affiniteetin mittaamiseen.
Paras sitojaklooni RS16D01 valittiin templaatiksi geneettiseen affiniteettimaturaatioon. Menetelmäksi valittiin CDR-L3 paikkamutaatiokirjaston luominen. Kirjastossa jokainen L3-loopin aminohappo satunnaistettiin paikkakohtaisesti. Tuotetut Fab:it seulottiin kuten aikaisemman sukupolven kloonit. Lopuksi parhaita Fab-klooneja tuotettiin SpyCatcher3 fuusioina immunoglobuliinin kaltaisten molekyylin luomiseksi.
L3-kirjaston Fab-kloonien sitomisominaisuuksissa ei huomattu parannusta RS16D01:een verrattuna, käytetyllä EC50-määrityksellä. Saadut EC50 arvot olivat 0,8–0,9 nM luokka kuten RS16D01-kloonin. Signaalien samankaltaisuus saattoi johtua määrityksen toteutuksesta, tai siitä, että L3-loopilla ei ole merkittävää vaikutusta affiniteettiin. SpyCatcher fuusiolla muodostetut sitojamolekyylit (IgG kaltaiset) puolestaan osoittautuivat toimivaksi menetelmäksi testin herkkyyden lisäämiseksi. Työssä tuotettuja Fab:eja testattiin sekä natiiveilla- että rekombinantti-virusproteiineilla.
Kehitetyt vasta-aineet ovat potentiaalisia immunoreagensseja esimerkiksi lateraalivirtausmääritykseen, mikäli affiniteettia pystytään edelleen parantamaan testien vaatimalle tasolle.