Structural Analysis of Triacylglycerols and Bioavailability of Docosahexaenoic Acid from Regio- and Enantiopure Triacylglycerols
Zhang, Yuqing (2025-05-19)
Structural Analysis of Triacylglycerols and Bioavailability of Docosahexaenoic Acid from Regio- and Enantiopure Triacylglycerols
(19.05.2025)
Turun yliopisto
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:ISBN:978-952-02-0169-2
https://urn.fi/URN:ISBN:978-952-02-0169-2
Tiivistelmä
Abstract
Triacylglycerols (TG) and glycerophospholipids (GPL) are essential lipid molecules found in food and play vital roles in human physiology. The diversity of fatty acids (FAs) and the presence of regioisomers and stereoisomers cause significant challenges to their structural analysis. In natural samples, the distribution of FAs on the glycerol backbone is not random, and the properties of isomers can vary considerably despite structural similarities. These structural variations can affect the physical properties or nutritional significance of fats and oils, such as the melting point and bioavailability of TGs and GPLs.
This thesis focuses on the structural analysis of enantiomeric TGs and the investigation of the bioavailability of FAs from regio- and enantiopure TGs. Using reference compounds, the research begins with a comprehensive study of the chiral chromatographic separation of TG enantiomers. A total of 33 TG enantiomer pairs, each comprising three different fatty acyls, were analyzed using recycling chiral high-performance liquid chromatography (HPLC), of which 26 pairs were successfully separated. The retention time at separation exhibited a negative correlation with the sn-3 carbon number of the first eluted enantiomer and a positive correlation with the carbon number difference between the outer positions. TGs with one saturated fatty acid (SFA) and one unsaturated fatty acid (UFA) at the outer positions were easier to separate, whereas TGs with two SFAs or two UFAs at sn-1/3 positions were more difficult to separate. Additionally, the results revealed that all three fatty acyls significantly influenced the chromatographic behavior in terms of carbon chain length and the number of double bonds (DBs). These results highlight the importance of steric hindrance and intermolecular interactions in determining the efficiency of the separation mechanism. This systematic study enhanced the understanding of the chiral chromatographic retention behavior and elution order of TG enantiomers.
The second part of this thesis investigated the nutritional and biological implications of fatty acyl positional isomers of TGs through an animal trial by exploring how the positional distribution of docosahexaenoic acid (DHA) in TGs influences the bioavailability and metabolic fate of DHA. Regio- and enantiopure TGs with DHA at the sn-1, sn-2, or sn-3 positions were synthesized and fed to rats for 4 weeks of intervention. During this time, body weight and food intake were monitored to assess physiological responses.
After the intervention, biological samples: plasma, visceral fat, and organs including the heart, liver, brain, lung, testis, spleen, eye, and kidney were collected for analysis. The FA composition of total lipids was analyzed. Additionally, polar and neutral lipids from plasma, liver, and kidney were fractionated, and FA composition was analyzed separately. Using a novel mass spectrometric methodology recently developed by our group and advanced data processing software, the molecular species and regioisomer composition of phosphatidylcholines (PC) in these tissues were identified, revealing the effects of positional distribution of FAs on lipid composition and metabolism. The results demonstrated significant differences in DHA content in the plasma and visceral fat between groups fed TGs with DHA at the sn-1 and sn-3 positions. Historically, the effect of positional distribution has been evaluated mainly through FA content and composition in tissues. Therefore, this study provides fresh insights into the impact of the sn-position of DHA in dietary TGs on GPL molecular species and regioisomer distribution for the first time. Furthermore, this research is the first to demonstrate that n-3 PUFA deficient diet altered GPL molecular species composition in organs, and DHA supplementation counteract these changes.
In conclusion, this thesis offers valuable contributions to understanding the composition and metabolism of chiral TGs, from analytical methodologies to biological evaluation. The study provides critical insights into the chromatographic behavior of TG enantiomers and highlights the impact of FA positional distribution on lipid chemistry and biology. These findings serve as foundational references for future stereospecific studies of natural lipids. TIIVISTELMÄ
Triasyyliglyserolit (TG) ja glyserofosfolipidit (GPL) ovat elintarvikkeiden välttämättömiä lipidimolekyylejä, joilla on elintärkeitä tehtäviä ihmisen fysiologiassa. Rasvahappojen monimuotoisuus sekä regioisomeerien ja stereoisomeerien esiintyminen aiheuttavat merkittäviä haasteita niiden rakenneanalyysille. Luonnon rasvoissa ja öljyissä rasvahapot eivät ole esteröityneet glyserolirunkoon sattumanvaraisesti, ja isomeerien ominaisuudet voivat rakenteellisesta samankaltaisuudestaan huolimatta poiketa huomattavasti toisistaan. Nämä rakenteelliset vaihtelut voivat vaikuttaa rasvojen ja öljyjen fysikaalisiin ominaisuuksiin kuten sulamispisteeseen ja rasvahappojen biosaatavuuteen TG:sta ja GPL:sta.
Tämä väitöskirjatyö keskittyy TG:n enantiomeerien rakenneanalyysiin ja rasvahappojen biosaatavuuteen regio- ja enantiopuhtaista TG:sta. Käytännön osuus alkaa kattavalla tutkimuksella keskittyen TG:n enantiomeerien kiraalikromatografiseen erottamiseen vertailuyhdisteiden avulla. Näytteen kierrätykseen perustuvalla kiraalisella korkean erotuskyvyn nestekromatografilla analysoitiin yhteensä 33 TG-enantiomeeriparia, joista 26 paria erotettiin onnistuneesti. Enantiomeerien erotukseen käytetty retentioaika korreloi negatiivisesti ensimmäisenä eluoituneen enantiomeerin sn-3-hiililuvun kanssa ja positiivisesti TG:n uloimpien asemien (sn-1 ja sn-3) rasvahappojen välisen hiililukueron kanssa. TG:t, joissa oli yksi tyydyttynyt ja yksi tyydyttymätön rasvahappo uloimmissa asemissa, erottuivat helpommin, kun taas TG:t, joissa oli kaksi tyydyttynyttä tai kaksi tyydyttymätöntä rasvahappoa sn-1/3-asemissa aiheuttivat suurempia haasteita erottamisessa. Lisäksi tulokset osoittivat, että kaikki kolme TG:n rasvahappoa vaikuttivat merkittävästi kromatografiseen eluutiokäyttäytymiseen hiiliketjun pituuden ja kaksoissidosten lukumäärän suhteen. Nämä tulokset korostavat steerisen esteen ja molekyylien välisten vuorovaikutusten merkitystä kromatografisessa erottumisessa. Tämä systemaattinen tutkimus lisäsi ymmärrystä TG:n enantiomeerien kiraalikromatografisesta retentiokäyttäytymisestä ja eluutiojärjestyksestä.
Työn toisessa osassa selvitettiin eläinkokeen avulla TG:n paikkaisomeerien ravitsemuksellisia ja biologisia vaikutuksia tutkimalla, miten dokosaheksaeenihapon (DHA) sijainti TG:ssa vaikuttaa DHA:n biosaatavuuteen ja metaboliaan. Regio- ja enantiopuhtaita TG:ja, joissa DHA oli sn-1-, sn-2- tai sn-3-asemassa, syntetisoitiin ja syötettiin rotille 4 viikon ajan. Tänä aikana seurattiin ruumiinpainoa ja ruoan saantia fysiologisten vasteiden arvioimiseksi.
Intervention jälkeen biologiset näytteet: plasma, viskeraalinen rasva ja elimet, mukaan lukien sydän, maksa, aivot, keuhkot, kivekset, perna, silmä ja munuaiset kerättiin analysoitavaksi. Näytteistä analysoitiin kokonaislipidien rasvahappokoostumus. Lisäksi plasman, maksan ja munuaisten polaariset ja neutraalit lipidit fraktioitiin ja rasvahappokoostumus analysoitiin erikseen. Ryhmämme vastikään kehittämän uudenaikaisen massaspektrometrimenetelmän ja kehittyneen tietojenkäsittelyohjelmiston avulla tunnistettiin fosfatidyylikoliiniyhdisteet ja niiden regioisomeerikoostumus näissä kudoksissa, mikä paljasti rasvahappojen paikkajakauman vaikutuksia lipidikoostumukseen ja aineenvaihduntaan. Tulokset osoittivat merkittäviä eroja plasman ja viskeraalisen rasvan DHA-pitoisuudessa niiden ryhmien välillä, joille syötettiin TG:a, joissa DHA oli sn-1- ja sn-3-asemissa. Perinteisesti paikkajakauman vaikutusta on arvioitu pääasiassa kudosten rasvahappopitoisuuden ja -koostumuksen perusteella. Näin ollen tässä tutkimuksessa saadaan ensimmäistä kertaa uutta tietoa ravinnon sisältämien TG:n DHA:n sn-aseman vaikutuksista GPL-molekyyleihin ja regioisomeerikoostumukseen. Lisäksi tämä tutkimus on ensimmäinen, jossa osoitetaan, että n-3 rasvahappojen suhteen puutteellinen ruokavalio muutti GPL:n molekyylikoostumusta ja että DHA-lisäys torjui näitä muutoksia.
Yhteenvetona voidaan todeta, että tämä tutkielma lisää merkittävästi kiraalisten TG-yhdisteiden koostumuksen ja aineenvaihdunnan ymmärtämistä, ulottuen analyyttisistä menetelmistä biologiseen arviointiin. Tutkimus tarjoaa kriittisen näkemyksen TG-enantiomeerien kromatografisesta käyttäytymisestä ja korostaa rasvahappojen paikkajakauman vaikutusta lipidien kemiaan ja biologiaan. Nämä havainnot toimivat perustavanlaatuisina viitteinä luonnollisten lipidien tuleville stereospesifisille tutkimuksille.
Triacylglycerols (TG) and glycerophospholipids (GPL) are essential lipid molecules found in food and play vital roles in human physiology. The diversity of fatty acids (FAs) and the presence of regioisomers and stereoisomers cause significant challenges to their structural analysis. In natural samples, the distribution of FAs on the glycerol backbone is not random, and the properties of isomers can vary considerably despite structural similarities. These structural variations can affect the physical properties or nutritional significance of fats and oils, such as the melting point and bioavailability of TGs and GPLs.
This thesis focuses on the structural analysis of enantiomeric TGs and the investigation of the bioavailability of FAs from regio- and enantiopure TGs. Using reference compounds, the research begins with a comprehensive study of the chiral chromatographic separation of TG enantiomers. A total of 33 TG enantiomer pairs, each comprising three different fatty acyls, were analyzed using recycling chiral high-performance liquid chromatography (HPLC), of which 26 pairs were successfully separated. The retention time at separation exhibited a negative correlation with the sn-3 carbon number of the first eluted enantiomer and a positive correlation with the carbon number difference between the outer positions. TGs with one saturated fatty acid (SFA) and one unsaturated fatty acid (UFA) at the outer positions were easier to separate, whereas TGs with two SFAs or two UFAs at sn-1/3 positions were more difficult to separate. Additionally, the results revealed that all three fatty acyls significantly influenced the chromatographic behavior in terms of carbon chain length and the number of double bonds (DBs). These results highlight the importance of steric hindrance and intermolecular interactions in determining the efficiency of the separation mechanism. This systematic study enhanced the understanding of the chiral chromatographic retention behavior and elution order of TG enantiomers.
The second part of this thesis investigated the nutritional and biological implications of fatty acyl positional isomers of TGs through an animal trial by exploring how the positional distribution of docosahexaenoic acid (DHA) in TGs influences the bioavailability and metabolic fate of DHA. Regio- and enantiopure TGs with DHA at the sn-1, sn-2, or sn-3 positions were synthesized and fed to rats for 4 weeks of intervention. During this time, body weight and food intake were monitored to assess physiological responses.
After the intervention, biological samples: plasma, visceral fat, and organs including the heart, liver, brain, lung, testis, spleen, eye, and kidney were collected for analysis. The FA composition of total lipids was analyzed. Additionally, polar and neutral lipids from plasma, liver, and kidney were fractionated, and FA composition was analyzed separately. Using a novel mass spectrometric methodology recently developed by our group and advanced data processing software, the molecular species and regioisomer composition of phosphatidylcholines (PC) in these tissues were identified, revealing the effects of positional distribution of FAs on lipid composition and metabolism. The results demonstrated significant differences in DHA content in the plasma and visceral fat between groups fed TGs with DHA at the sn-1 and sn-3 positions. Historically, the effect of positional distribution has been evaluated mainly through FA content and composition in tissues. Therefore, this study provides fresh insights into the impact of the sn-position of DHA in dietary TGs on GPL molecular species and regioisomer distribution for the first time. Furthermore, this research is the first to demonstrate that n-3 PUFA deficient diet altered GPL molecular species composition in organs, and DHA supplementation counteract these changes.
In conclusion, this thesis offers valuable contributions to understanding the composition and metabolism of chiral TGs, from analytical methodologies to biological evaluation. The study provides critical insights into the chromatographic behavior of TG enantiomers and highlights the impact of FA positional distribution on lipid chemistry and biology. These findings serve as foundational references for future stereospecific studies of natural lipids.
Triasyyliglyserolit (TG) ja glyserofosfolipidit (GPL) ovat elintarvikkeiden välttämättömiä lipidimolekyylejä, joilla on elintärkeitä tehtäviä ihmisen fysiologiassa. Rasvahappojen monimuotoisuus sekä regioisomeerien ja stereoisomeerien esiintyminen aiheuttavat merkittäviä haasteita niiden rakenneanalyysille. Luonnon rasvoissa ja öljyissä rasvahapot eivät ole esteröityneet glyserolirunkoon sattumanvaraisesti, ja isomeerien ominaisuudet voivat rakenteellisesta samankaltaisuudestaan huolimatta poiketa huomattavasti toisistaan. Nämä rakenteelliset vaihtelut voivat vaikuttaa rasvojen ja öljyjen fysikaalisiin ominaisuuksiin kuten sulamispisteeseen ja rasvahappojen biosaatavuuteen TG:sta ja GPL:sta.
Tämä väitöskirjatyö keskittyy TG:n enantiomeerien rakenneanalyysiin ja rasvahappojen biosaatavuuteen regio- ja enantiopuhtaista TG:sta. Käytännön osuus alkaa kattavalla tutkimuksella keskittyen TG:n enantiomeerien kiraalikromatografiseen erottamiseen vertailuyhdisteiden avulla. Näytteen kierrätykseen perustuvalla kiraalisella korkean erotuskyvyn nestekromatografilla analysoitiin yhteensä 33 TG-enantiomeeriparia, joista 26 paria erotettiin onnistuneesti. Enantiomeerien erotukseen käytetty retentioaika korreloi negatiivisesti ensimmäisenä eluoituneen enantiomeerin sn-3-hiililuvun kanssa ja positiivisesti TG:n uloimpien asemien (sn-1 ja sn-3) rasvahappojen välisen hiililukueron kanssa. TG:t, joissa oli yksi tyydyttynyt ja yksi tyydyttymätön rasvahappo uloimmissa asemissa, erottuivat helpommin, kun taas TG:t, joissa oli kaksi tyydyttynyttä tai kaksi tyydyttymätöntä rasvahappoa sn-1/3-asemissa aiheuttivat suurempia haasteita erottamisessa. Lisäksi tulokset osoittivat, että kaikki kolme TG:n rasvahappoa vaikuttivat merkittävästi kromatografiseen eluutiokäyttäytymiseen hiiliketjun pituuden ja kaksoissidosten lukumäärän suhteen. Nämä tulokset korostavat steerisen esteen ja molekyylien välisten vuorovaikutusten merkitystä kromatografisessa erottumisessa. Tämä systemaattinen tutkimus lisäsi ymmärrystä TG:n enantiomeerien kiraalikromatografisesta retentiokäyttäytymisestä ja eluutiojärjestyksestä.
Työn toisessa osassa selvitettiin eläinkokeen avulla TG:n paikkaisomeerien ravitsemuksellisia ja biologisia vaikutuksia tutkimalla, miten dokosaheksaeenihapon (DHA) sijainti TG:ssa vaikuttaa DHA:n biosaatavuuteen ja metaboliaan. Regio- ja enantiopuhtaita TG:ja, joissa DHA oli sn-1-, sn-2- tai sn-3-asemassa, syntetisoitiin ja syötettiin rotille 4 viikon ajan. Tänä aikana seurattiin ruumiinpainoa ja ruoan saantia fysiologisten vasteiden arvioimiseksi.
Intervention jälkeen biologiset näytteet: plasma, viskeraalinen rasva ja elimet, mukaan lukien sydän, maksa, aivot, keuhkot, kivekset, perna, silmä ja munuaiset kerättiin analysoitavaksi. Näytteistä analysoitiin kokonaislipidien rasvahappokoostumus. Lisäksi plasman, maksan ja munuaisten polaariset ja neutraalit lipidit fraktioitiin ja rasvahappokoostumus analysoitiin erikseen. Ryhmämme vastikään kehittämän uudenaikaisen massaspektrometrimenetelmän ja kehittyneen tietojenkäsittelyohjelmiston avulla tunnistettiin fosfatidyylikoliiniyhdisteet ja niiden regioisomeerikoostumus näissä kudoksissa, mikä paljasti rasvahappojen paikkajakauman vaikutuksia lipidikoostumukseen ja aineenvaihduntaan. Tulokset osoittivat merkittäviä eroja plasman ja viskeraalisen rasvan DHA-pitoisuudessa niiden ryhmien välillä, joille syötettiin TG:a, joissa DHA oli sn-1- ja sn-3-asemissa. Perinteisesti paikkajakauman vaikutusta on arvioitu pääasiassa kudosten rasvahappopitoisuuden ja -koostumuksen perusteella. Näin ollen tässä tutkimuksessa saadaan ensimmäistä kertaa uutta tietoa ravinnon sisältämien TG:n DHA:n sn-aseman vaikutuksista GPL-molekyyleihin ja regioisomeerikoostumukseen. Lisäksi tämä tutkimus on ensimmäinen, jossa osoitetaan, että n-3 rasvahappojen suhteen puutteellinen ruokavalio muutti GPL:n molekyylikoostumusta ja että DHA-lisäys torjui näitä muutoksia.
Yhteenvetona voidaan todeta, että tämä tutkielma lisää merkittävästi kiraalisten TG-yhdisteiden koostumuksen ja aineenvaihdunnan ymmärtämistä, ulottuen analyyttisistä menetelmistä biologiseen arviointiin. Tutkimus tarjoaa kriittisen näkemyksen TG-enantiomeerien kromatografisesta käyttäytymisestä ja korostaa rasvahappojen paikkajakauman vaikutusta lipidien kemiaan ja biologiaan. Nämä havainnot toimivat perustavanlaatuisina viitteinä luonnollisten lipidien tuleville stereospesifisille tutkimuksille.
Kokoelmat
- Väitöskirjat [2913]