Regulatory Mechanisms involved in Th2 Cell Differentiation. A Proteomics Approach.

Abstract

<b>Th2-solujen erilaistumista ohjaavat säätelyverkostot ja niiden tutkiminen proteomiikan avulla</b>

Astma ja allergiat ovat laajalle levinneitä ja vakavia sairauksia, joista kärsivät miljoonat ihmiset ympäri maailmaa. Koe-eläimillä tehdyt tutkimukset osoittavat, että interleukiini-4 (IL-4) on tärkeä allergisen astman ja allergioiden kehittymiselle ja kroonistumiselle. Se ohjaa T-auttajasolujen (Th-solujen) kehittymistä Th2-tyypin soluiksi, joilla on merkittävä rooli näiden tautien puhkeamisessa. Th2-solut tuottavat myös itse IL-4:ä, joka edesauttaa taudin seuraavien vaiheiden kehittymistä. Erityisesti STAT6-proteiini, joka aktivoituu IL-4-stimulaation seurauksena, on tarpeen Th2- vasteen syntymiselle ja kroonistumiselle antigeenin aiheuttamassa keuhkoputkien astmaattisessa tulehduksessa.

Väitöskirjatyöni tarkoituksena oli käyttää kaksidimensionaaliseen elektroforeesiin (2- DE) perustuvaa proteomiikkaa ja massaspektrometriaa uusien Th2-solujen erilaistumista säätelevien proteiinien tunnistamiseksi. Erilaistumattomat Th-solut eristettiin vastasyntyneen napaverestä tai hiiren pernasta. Solut aktivoitiin Tsolureseptorin ja ns. ko-stimulatoristen reseptorien kautta ja erilaistettiin joko Th1- tai Th2-suuntaan vastaavasti erilaistavien IL-12- ja IL-4-sytokiinien avulla. Ensimmäisessä tutkimuksessa in vitro -erilaistettujen Th1- ja Th2-solujen proteomeja verrattiin keskenään proteiinien ilmenemisessä tai proteiinimodifikaatioissa olevien erojen tunnistamiseksi. Kaksi muuta päätutkimusta keskittyivät IL-4:n aiheuttamaan proteiinitason säätelyyn ensimmäisen vuorokauden aikana T-soluaktivaation jälkeen. Näistä ensimmäisessä IL-4:n aiheuttamia eroja tunnistettiin aktivoiduista ihmisen Thsoluista. IL-4:n todettiin säätelevän useita proteiineja kaspaasien välittämissä signalointiteissä sekä lisäävän T-solujen elävyyttä ja aktivoitumista. Toisessa tutkimuksessa STAT6-poistogeenisten hiirien lymfosyyttien proteomia verrattiin villityypin kontrollisoluihin T-soluaktivaation ja IL-4-stimulaation jälkeen. Näissä tutkimuksissa karakterisoitiin useita uusia IL-4:n ja STAT6:n kohdeproteiineja ja löydettiin uusia säätelyverkostoja. Tutkimustulokset ovat johtaneet uusiin Th2-erilaistumismekanismeja koskeviin hypoteeseihin.

Asthma and allergies are prevalent and severe diseases that affect millions of individuals worldwide. In vivo animal studies indicate that interleukin-4 (IL-4) is important for the development and perpetuation of allergic asthma and allergy. It is needed for the proper development of Th2 type effector cells that have a key role in the onset of these diseases. IL-4 is also produced by Th2 cells and it promotes the subsequent stages of these diseases. The signal transducer and activator of transcription 6 (STAT6), which is activated by IL-4 stimulation, is especially needed to acquire and maintain Th2 type responses in antigen induced asthmatic airway inflammation.

The general aim of this doctoral thesis was to identify novel proteins important for Th2 cell differentiation using two-dimensional electrophoresis (2-DE) based proteomics and mass spectrometry. Undifferentiated T helper cells were isolated from human umbilical cord blood or mouse spleen. Cells were activated through T cell and costimulatory receptors and differentiated in the Th1 or Th2 direction with the polarizing cytokines IL-12 and IL-4, respectively. In the first study, the proteomes of <i>in vitro</i> differentiated human Th1 and Th2 cells were compared to identify differences in the protein expression levels or in the protein modifications. The subsequent studies focused on IL-4 induced protein regulation within 24 hours after T cell activation. In the first of these, IL-4 induced differences were identified from activated human T helper cells. IL-4 was found to regulate several proteins in caspase mediated pathways and to enhance T cell survival and activation. In the other, the proteomes of STAT6 deficient mouse lymphocytes were compared to the wild-type control cells after T cell activation and IL-4 stimulation. In these studies overall, we have characterized several new IL-4 and STAT6 target proteins and revealed new regulatory networks, which has provided new hypothesis on the mechanisms of Th2 cell differentiation.