Quantitative proteomics in the characterization of T helper lymphocyte differentiation

Abstract

The term proteome is used to define the complete set of proteins expressed in cells or tissues of an organism at a certain timepoint. Respectively, proteomics is used to describe the methods, which are used to study such proteomes. These methods include chromatographic and electrophoretic techniques for protein or peptide fractionation, mass spectrometry for their identification, and use of computational methods to assist the complicated data analysis.

A primary aim in this Ph.D. thesis was to set-up, optimize, and develop proteomics methods for analysing proteins extracted from T-helper (Th) lymphocytes. First, high-throughput LC-MS/MS and ICAT labeling methods were set-up and optimized for analysing the microsomal fraction proteins extracted from Th lymphocytes. Later, iTRAQ method was optimized to study cytokine regulated protein expression in the nuclei of Th lymphocytes. High-throughput LC-MS/MS analyses, like ICAT and iTRAQ, produce large quantities of data and robust software and data analysis pipelines are needed. Therefore, different software programs used for analysing such data were evaluated. Moreover, a pre-filtering algorithm was developed to classify good-quality and bad-quality spectra prior to the database searches.

Th-lymphocytes can differentiate into Th1 or Th2 cells based on surrounding antigens, co-stimulatory molecules, and cytokines. Both subsets have individual cytokine secretion profiles and specific functions. Th1 cells participate in the cellular immunity against intracellular pathogens, while Th2 cells have important role in the humoral immunity against extracellular parasites. An abnormal response of Th1 and Th2 cells and imbalance between the subsets are charasteristic of several diseases. Th1 specific reactions and cytokines have been detected in autoimmune diseases, while Th2 specific response and cytokine profile is common in allergy and asthma.

In this Ph. D. thesis mass spectrometry-based proteomics was used to study the effects of Th1 and Th2 promoting cytokines IL-12 and IL-4 on the proteome of Th lymphocytes. Characterization of microsomal fraction proteome extracted from IL-12 treated lymphobasts and IL-4 stimulated cord blood CD4+ cells resulted in finding of cytokine regulated proteins. Galectin-1 and CD7 were down-regulated in IL-12 treated cells, while IL-4 stimulation decreased the expression of STAT1, MXA, GIMAP1, and GIMAP4. Interestingly, the transcription of both <i>GIMAP</i> genes was up-regulated in Th1 polarized cells and down-regulated in Th2 promoting conditions.

Proteomilla tarkoitetaan organismin solujen tai kudosten tietyllä ajanhetkellä ilmentämiä proteiineja. Proteomiikka puolestaan käsittää menetelmät, joiden avulla tutkitaan proteomeja. Näihin menetelmiin kuuluvat kromatografiset ja elektroforeettiset tekniikat proteiinien ja peptidien fraktiointiin, massaspektrometria niiden tunnistamiseen sekä tietojenkäsittely menetelmät avustamaan tietojen analysointia.

Väitöskirjan osatöiden tarkoituksena oli pystyttää, optimoida ja kehittää proteomiikan tutkimusmenetelmiä T-auttajasoluista (Th) eristettyjen proteiinien tutkimiseen. Aluksi pystytettiin ja optimoitiin LC-MS/MS- ja ICAT-menetelmät. Th-solujen mikrosomaalisten fraktioiden analysoimiseksi. Myöhemmin iTRAQ-menetelmä optimoitiin Th-solujen tuman proteomin tutkimiseksi. ICAT- ja iTRAQ-menetelmien kaltaiset LC-MS/MS-menetelmät tuottavat paljon tietoa, minkä analysoimiseksi tarvitaan tehokkaita tietokoneohjelmia ja tietojen analysointijärjestelmiä. Tämän vuoksi väitöskirjatyössä arvioitiin massaspektrometrillä mitattujen spektrien analysointiin soveltuvia tietokoneohjelmia. Lisäksi kehitettiin algoritmi, jonka avulla voidaan erotella laadultaan hyvät ja huonot spektrit toisistaan ennen tietokantahakuja.

Th-solut voivat erilaistua Th1- tai Th2-soluiksi ympäröivien antigeenien, ko-stimuloivien molekyylien ja sytokiinien vaikutuksesta. Molemmilla alatyypeillä on yksilölliset sytokiinien tuottoprofiilit ja spesifiset tehtävät. Th1-solut osallistuvat soluvälitteiseen immuniteettiin solunsisäisiä taudinaiheuttajia vastaan, kun taas Th2-soluilla on tärkeä rooli vasta-ainevälitteisessä immuniteetissä solunulkoisia loisia vastaan. Th1- ja Th2-solujen epänormaali vaste ja solupopulaatioiden välinen epätasapaino voivat johtaa sairauksiin. Th1-soluille ominaisia reaktioita ja sytokiineja on havaittu autoimmuunisairauksissa, kun taas Th2-soluille tyypillinen vaste ja sytokiiniprofiili ovat ominaisia allergiassa ja astmassa.

Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin massaspektrometriaan perustuvan proteomiikan avulla Th1 ja Th2 erilaistavien sytokiinien IL-12 ja IL-4 vaikutusta Th-solujen proteomiin. IL-12:lla stimuloiduista perifeerisen veren Th-soluista ja IL-4:llä stimuloiduista napaveren Th-soluista eristettiin mikrosomaaliset fraktiot, joiden proteomeissa havaittiin sytokiinien säätelemiä proteiineja. Galektiini-1:n ja CD7:n ekspressio väheni IL-12:n vaikutuksesta ja IL-4 puolestaan vähensi STAT1:n, MXA:n, GIMAP1:n ja GIMAP4:n ilmenemistä. Molempien <i>GIMAP </i>geenien transkription havaittiin vähenevän IL-4:n vaikutuksesta ja lisääntyvän IL-12:n vaikutuksesta.