Luminescence-based assay methods in drug discovery

Abstract

The drug discovery process is facing new challenges in the evaluation process of the lead compounds as the number of new compounds synthesized is increasing. The potentiality of test compounds is most frequently assayed through the binding of the test compound to the target molecule or receptor, or measuring functional secondary effects caused by the test compound in the target model cells, tissues or organism.

Modern homogeneous high-throughput-screening (HTS) assays for purified estrogen receptors (ER) utilize various luminescence based detection methods. Fluorescence polarization (FP) is a standard method for ER ligand binding assay. It was used to demonstrate the performance of two-photon excitation of fluorescence (TPFE) vs. the conventional one-photon excitation method. As result, the TPFE method showed improved dynamics and was found to be comparable with the conventional method. It also held potential for efficient miniaturization. Other luminescence based ER assays utilize energy transfer from a long-lifetime luminescent label e.g. lanthanide chelates (Eu, Tb) to a prompt luminescent label, the signal being read in a time-resolved mode. As an alternative to this method, a new single-label (Eu) time-resolved detection method was developed, based on the quenching of the label by a soluble quencher molecule when displaced from the receptor to the solution phase by an unlabeled competing ligand. The new method was paralleled with the standard FP method. It was shown to yield comparable results with the FP method and found to hold a significantly higher signal-tobackground ratio than FP.

Cell-based functional assays for determining the extent of cell surface adhesion molecule (CAM) expression combined with microscopy analysis of the target molecules would provide improved information content, compared to an expression level assay alone. In this work, immune response was simulated by exposing endothelial cells to cytokine stimulation and the resulting increase in the level of adhesion molecule expression was analyzed on fixed cells by means of immunocytochemistry utilizing specific long-lifetime luminophore labeled antibodies against chosen adhesion molecules. Results showed that the method was capable of use in amulti-parametric assay for protein expression levels of several CAMs simultaneously, combined with analysis of the cellular localization of the chosen adhesion molecules through time-resolved luminescence microscopy inspection.

Uusien johtoyhdisteiden etsintä lääkekehitysprosessissa on jatkuvasti uusien haasteiden edessä, koska tähän tarkoitukseen syntetisoitujen yhdisteiden määrä kasvaa jatkuvasti. Uusien yhdisteiden soveltuvuutta testataan yleensä määrittämällä yhdisteen sitoutumisvoimakkuus kohdemolekyyliin tai -reseptoriin tai toiminnallisilla testeillä mittaamalla yhdisteen aiheuttamia vaikutuksia kohdesoluissa tai -kudoksessa tai kohteeksi valitussa eliössä.

Estrogeenireseptoriin (ER) sitoutuvia yhdisteitä eristetyillä reseptoreilla testattaessa käytetään usein homogeenisia luminesenssiin perustuvia tehoseulontamenetelmiä. Fluoresenssipolarisaatio (FP) on standardimetodeja mitattaessa ER:iin sitoutumista. Kaksifotoniviritteisen fluoresenssi -tekniikan soveltuvuutta perinteiseen yksifotoniviritteiseen verrattuna testattiin ER:n ligandin sitoutumisen FP-sovelluksella. Tuloksena todettiin kaksifotoniviritystekniikan olevan yhtäläinen yksifotoniviritykseen verrattuna sekä lisäksi havaittiin mahdollisuudet määritysdynamiikan tehostamiseen ja tehokkaaseen määritystilavuuden pienentämiseen. Jotkut luminesenssiin perustuvat ER:n ligandinsitoutumismenetelmät hyödyntävät energiansiirtoa pitkäikäisen luminoivan leiman kuten lantanidikelaatin (Eu, Tb) ja lyhytikäisen luminoivan leiman välillä. Vaihtoehtona näille menetelmille kehitettiin uusi yksileimamenetelmä (Eu), jossa leiman luminesenssi sammuu liukoisen sammutinmolekyylin johdosta silloin, kun sitoutumisesta kilpaileva leimaamaton ligandi syrjäyttää leimamolekyylin reseptorista liuokseen. Uutta menetelmää testattiin FP:tä verrokkimenetelmänä käyttäen ja tulokset osoittivat uudella menetelmällä saavutettavan huomattava signaali/tausta -suhteen parannus sekä menetelmän olevan vertailukelpoinen FP:n kanssa.

Solupohjainen pintaproteiiniekspression määritys yhdistettynä mikroskooppianalyysiin antaisi arvokasta lisätietoa kohdeproteiinien olemuksesta verrattuna pelkkään ekspressiotason määritykseen. Tässä työssä immuunivastetta jäljiteltiin endoteelisolujen sytokiinistimulaatiolla, ja siitä seurannutta adheesiomolekyylien ekspressiotason nousua mitattiin fiksoiduista soluista immunosytokemian menetelmin käyttämällä pitkäikäisillä luminoivilla leimoilla varustettuja vasta-aineita, jotka spesifisesti tunnistivat valitut kohdeproteiinit. Tuloksena saavutettiin solun pintaproteiinien kvantitatiivinen määritysmenetelmä, jolla useita proteiineja voidaan määrittää samassa kokeessa ja lisäksi tarkastella näiden lokalisaatiota soluissa pitkäikäiseen luminesenssiin soveltuvalla mikroskoopilla.