Immunokomplekseja sitovien vasta-aineiden tunnistaminen sekvenssianalyysillä
1.59 MB
avoin
Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.
Lataukset884
Pysyvä osoite
Verkkojulkaisu
DOI
Tiivistelmä
Uuden polven sekvensointimenetelmät ovat kehittyneet viimevuosina nopeasti. Sekvensointilaitteiden kehittymisen myötä menetelmät ovat muuttuneet yhä luotettavammiksi, joustavimmiksi ja edullisimmiksi. Tämä on mahdollistanut uusien vasta-aineseulontamenetelmien kehittämisen, ja ennustaa uuden polven sekvensointimenetelmiin pohjautuvien tekniikoiden yleistymistä vasta-ainekehityksessä.
Turun yliopiston biotekniikan laitoksella kehitettyjen synteettisten vasta-ainekirjastojen avulla on mahdollista seuloa vasta-aineita, joita on vaikea kehittää perinteisen eläinten immunisaation avulla. Tällä hetkellä faaginäyttötekniikan ongelmana on parhaiden vasta-aineiden löytäminen tuhansien kloonikandidaattien joukosta. Uuden polven sekvensointimenetelmät tarjoavat mahdollisuuden valvoa vasta-aineiden rikastumista faaginäyttöseulonnan aikana. Lisäksi käyttämällä DNA-pohjaisia viivakooditunnisteita voidaan sekvensoida yhden ajon aikana jopa kymmeniä eri näytteitä. Yhdistämällä kirjastoja voidaan vasta-aine kehitykselle selvittää optimaaliset olosuhteet pelkän uuden polven sekvensoinnista saadun tiedon perusteella.
Tässä työssä hyödynnettiin uuden polven sekvensointitekniikkaa sekä bioinformatiikan työkaluja skatoli-, testosteroni-, mikrokystiini-LR- ja mikroystiini-RR-immunokomplekseja sitovien vasta-aineineiden tunnistamisessa, sekä niiden sitomisominaisuuksien määrittämisessä. Näytteinä käytettiin faaginäyttötekniikan ensimmäisen ja neljännen selektiokierroksen jälkeen eristettyjä kokonaisia scFv-M13-faageja sekä niistä eristettyä faagemidi-DNA:ta. Näytteet viivakoodattiin DNA-tunnistusalukkeilla ja sekvensoitiin Illumina Miseq sekvensointialustalla. Bioinformatiikkaa hyödyntäen sekvensseistä pystyttiin tunnistamaan CDRH3-alueet, joiden rikastumiskertoimia vertailemalla määritettiin sekvenssit, jotka ennustivat hyvää sitoutumista immunokomplekseja vastaan. Lisäksi sitoutumisominaisuuksien määrittämiseksi sekvenssien rakenteita vertailtiin toisiinsa klusterianalyysissä. Tutkimuksessa onnistuttiin löytämään uusia hyvin rikastuneita, mikrokystiini-LR:lle spesifisiä CDRH3-sekvenssejä, joita ei ole aiemmin pystytty Turun yliopistossa havaitsemaan perinteisiä menetelmiä käyttäen. Testosteroni- ja skatolikirjastoissa sekvenssien monimuotoisuus oli huomattavasti suurimpi kuin pidemmälle rikastetuissa mikrokystiinikirjastoissa. Skatolin tai testosteroni muodostamille immunokomplekseille ei tässä työssä onnistuttu sekvensointidatan perusteella löytämään muita selkeästi enemmän rikastuneita ja spesifisempinä erottuvia CDRH3-sekvenssejä.