Hydrofobiseen vuorovaikutuskromatografiaan perustuvan karakterisointimenetelmän kehittäminen Eu-kelaateille leimatuille vasta-aineille

Abstract

Aikaerotteista fluorometriaa, jossa käytetään luminoivia lantanoidikelaatteja, voidaan hyödyntää immunomäärityksissä. Vasta-aineisiin konjugoidaan fluoresoivia leima-aineita, joiden avulla voidaan tunnistaa halutun analyytin läsnäolo näytteessä. Suuri Stokes-siirtymä, emission pitkäikäisyys sekä mahdollisuus käyttää useita näytematriiseja tekevät kaikki aikaerotteisesta fluorometriasta houkuttelevan vaihtoehdon. Vasta-aineissa on useita funktionaalisia ryhmiä, joita voidaan käyttää lantanoidikelaattien kovalenttiseen konjugaatioon. Yleinen konjugaatiokohta on lysiinitähteiden aminoryhmät, joiden kanssa reagoidessaan leimat kiinnittyvät satunnaisesti osaan vasta-aineiden lysiiniryhmistä. Näin syntyvä tuote on heterogeeninen. Herkän havaitsemisen mahdollistamiseksi on toivottavaa leimata mahdollisimman monta lantanoidileimaa lopulliseen tuotteeseen eli tuotteelle halutaan mahdollisimman korkea leima-aste. Tämä on mahdollista, sillä suuren Stokes-siirtymän vuoksi lantanoidikelaatit ovat harvoin alttiita itsesammuttamiselle. Kuitenkin liian korkea leima-aste voi vaikuttaa leimatun vasta-aineen sitoutumiseen analyytin kanssa. Tällä hetkellä leima-aste määritetään menetelmillä, joka antaa vain keskiarvon leimatun vasta aineen leima-asteesta. Tämän Radiometer Turku Oy:lle tehdyn diplomityön tarkoituksena oli tutkia hydrofobiseen vuorovaikutuskromatografiaan perustuvan menetelmän soveltuvuutta leima-asteen karakterisointiin. Menetelmän haluttiin erottelevan leimattuja vasta-aineita niiden leima-asteen perusteella. Menetelmän toimivuutta vertailtiin tutkimalla erilaisia matriiseja sekä optimoimalla suolan, pH:n ja liuottimen vaikutusta erotteluun. Lopulta menetelmä sovitettiin korkean erotuskyvyn nestekromatografiaan. Tutkimuksen tulokset osoittivat, että menetelmä on tehokas erottamaan leimatut ja leimaamattomat vasta-aineet sekä tunnistamaan erilaisia leimauksia. Menetelmä on erityisen hyödyllinen alhaisen leima-asteen tunnistamisessa, kun taas korkean leima-asteen vasta aineiden erotteleminen on haastavampaa liian voimakkaan sitoutumisen vuoksi. Lisäksi suhteelliset erot korkean leima-asteen vasta-aineiden hydrofobisuudessa ovat pienempiä kuin matalalla leima-asteella. Kehitetty menetelmä mahdollistaa uuden tavan parantaa leimattujen vasta-aineiden laadunvalvontaa.