Onkogeenisen kRAS-proteiinin toiminnan estäminen

Abstract

KRAS (Kirsten rat sarcoma) on kRAS-proteiinia tuottava geeni. kRAS-proteiini kuuluu GTPaasi superperheeseen ja sen toiminta perustuu GTP:n sitoutumiseen. KRAS-geenin aktivaatio aikaansaa useita signalointireittejä, jotka säätelevät esimerkiksi solun proliferaatiota, erilaistumista ja selviämistä. Mutaatio KRAS-geenissä johtaa GTP:n sitoutumisen lisääntymiseen ja GTP:n hydrolyysin häiriöihin, jolloin kRAS-proteiini pysyy jatkuvasti aktiivisena. Tämä johtaa aktivaatioreittien toiminnan lisääntymiseen.

Mutaatiot KRAS-geenissä aiheuttavat noin 25 % kaikista syövistä ja se on helposti mutatoituva onkogeeni. Esimerkiksi 85–90 % kaikista haimasyövistä on onkogeenisen KRAS-geenin aiheuttamia. kRAS-proteiinin syöpää aiheuttavia mutaatioita ovat G12C, G12D, G12V ja Q61. Onkogeenisella kRAS-proteiinilla on uniikki reaktiotie, jonka takia syöpien hoito on vaikeaa. kRAS-proteiinin toimintaa säätelevien lääkkeiden kehitys on haastavaa, sillä proteiinista puuttuvat esimerkiksi tyypilliset lääkkeitä sitovat kohdat.

Työn tavoitteena on löytää molekyylejä, jotka estävät syöpää aiheuttavien kRAS-mutanttien toiminnan soluissa. Tässä tutkimuksessa keskitymme G12D ja G12V mutaatioihin. Tätä varten tuotamme villityypin kRAS ja kRAS-G12V-proteiinin GST-fuusiona Escherichia coli-bakteerissa. Työssä tuotamme ja puhdistamme itse kRAS-villityypin ja kRAS-G12V-proteiinin. Proteiinit puhdistetaan yhdistämällä affiniteetti- ja kokoerottelukromatografiaa. kRAS-G12D-proteiini on kaupallinen. Yhteistyökumppanin suunnittelemien molekyylien sitoutumista KRAS proteiineihin seurataan mikroskaala termoforeesin (MST) avulla.

Tuotimme ja puhdistimme kRAS-wt ja kRAS-G12V. kRAS-G12D oli kaupallinen. Testasimme 51 ennalta seulottua molekyyliä MST:n ja DSF:n avulla. Löysimme molekyylejä, jotka sitoutuivat kRAS-proteiineihin. Näistä valitsimme sitoutumisen affiniteettia mittaaviin mittauksiin ne molekyylit, jotka sitoutuivat ainoastaan onkogeenisiin kRAS-proteiineihin.