Solun proteiinien lämpöstabiilisuus määritykset lääkemolekyylien toiminnallisuuden havainnoinnissa

Abstract

Lääkekehityksessä on tärkeää, että yhdiste sitoutuu spesifisesti haluttuun kohteeseen, mikä mahdollistaa sekä tehokkuuden että turvallisuuden. Tätä varten lääkkeen tulee olla oikeassa paikassa ja sitoutua haluttuun kohteeseen korkealla spesifisyydellä. TSA, eli lämpösiirtymäanalyysi on tutkimusmenetelmä, jonka avulla lääkeaineiden toiminnallisuutta voidaan tutkia proteiinien lämpöstabiilisuuden avulla. Menetelmässä puhdistetun proteiinin lämpöstabiilisuutta tutkitaan fluoresoivan väriaineen avulla, joka sitoutuu denaturoituneen proteiinin hydrofobisiin alueisiin. CETSA, eli solullinen lämpösiirtymäanalyysi kehitettiin, jotta voitiin tutkia yhdisteiden ja niiden kohdeproteiinien vuorovaikutuksia fysiologisesti merkittävässä ympäristössä lämpöstabiilisuuden avulla. CETSAssa mittaukset suoritetaan soluympäristössä kokonaisissa soluissa, kudoksessa tai solulysaatissa. Mittauksissa tutkitaan miten eri molekyylit sitoutuvat kohdeproteiineihin ja miten tämä vaikuttaa proteiinin lämpöstabiilisuuteen, rakenteeseen ja toimintaan niiden luonnollisessa ympäristössä. Proteiinien lämpöstabiilisuutta arvioidaan denaturoitumisen ja aggregaation perusteella. Kuumentamisen jälkeen näytteen liukoisten proteiinien määrä voidaan mitata ja luoda näille lämpökäyrä. Tyypillisesti sitoutuva molekyyli stabiloi kohdeproteiinia, jolloin yhdisteen vuorovaikutus proteiinin kanssa voidaan havaita lämpökäyrässä proteiinin sulamispisteen muutoksena Tm. CETSAsta on useita variaatioita, jotka toimivat saman toimintaperiaatteen mukaisesti, mutta eroavat siinä, mitä menetelmää käytetään proteiinin määrityksessä kuumentamisen jälkeen. Eri menetelmiä käytetään yksittäisten proteiinien tutkimiseen, laajoihin seulontoihin sekä koko proteomin kattaviin analyyseihin. Tässä tutkielmassa keskitytään CETSAan, sen käyttöön lääkekehityksessä sekä sen eri variaatioiden toimintaan.